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Studies on the insecticidal mechanism of Bacillus thuringiensis Vip3A and Cry proteins

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El control de plagas y patógenos ha tenido un efecto importante en la mejora del rendimiento de los sistemas agrícolas a nivel mundial. Diferentes tipos de insecticidas químicos se han usado extensivamente durante mucho tiempo para el control de plagas de insectos. Debido a la aparición de resistencias, problemas de contaminación de aguas y problemas de salud humana causados por dichos insecticidas de síntesis, la agricultura moderna necesita una estrategia de gestión integrada de plagas más saludable, respetuosa con el medio ambiente y sostenible. El uso de Bacillus thuringiensis (Bt) y sus proteínas insecticidas para el control de plagas es una de las estrategias biotecnológicas más importantes hasta la fecha. Además, los genes que codifican sus proteínas insecticidas han sido transferidos a plantas, las cuales están siendo utilizadas comercialmente, desde 1996 en gran parte del mundo para el control eficiente de numerosas plagas de insectos. En los últimos años, una nueva subclase de proteínas insecticidas secretables (Vip3) producida durante el crecimiento vegetativo de Bt se ha considerado para la aplicación combinada con las convencionalmente empleadas proteínas Cry, cuya aplicación se ve amenazada por la aparición de poblaciones de insectos resistentes. Las proteínas Vip3 no tienen homología de secuencia con las proteínas Cry y son tóxicas para insectos lepidópteros, sin embargo, su modo de acción todavía no se conoce completamente. En este proyecto de tesis, con el objetivo de mejorar su aplicación en el control biotecnológico de plagas y la comprensión del modo de acción de las proteínas Vip3, se estudiaron diversos aspectos de su actividad insecticida (espectro de acción, resistencia cruzada e interacción con otras proteínas), y se realizó un estudio de los residuos clave para el mantenimiento de la estructura tridimensional y la toxicidad de la proteína Vip3Af mediante mutagénesis dirigida. También analizamos la posible implicación de la unión a receptores en la aparición de resistencia utilizando una cepa resistente que había sido seleccionada con Vip3Aa. En primer lugar, se investigó la toxicidad de 10 toxinas Bt (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ah, Cry1Fa, Cry2Aa, Cry2b, Cry1Ie, Vip3Aa19, Vip3Aa16 y Vip3Ca) frente a Mythimna separata (plaga agrícola muy destructiva en Asia y Australia), así como su aplicación combinada mediante bioensayos llevados a cabo en laboratorio. Los resultados mostraron que la concentración letal media LC50 (Cry1Ac/Vip3Aa19/Vip3Ca 3061 veces) se obtuvo rápidamente después de 8 o 9 generaciones de selección en laboratorio. Sin embargo, no se obtuvo resistencia notable seleccionando con Cry1Ab o Cry1F en la misma población y durante el mismo número de generaciones. En un estudio realizado por otros investigadores, también se encontró una respuesta rápida similar a la selección de Vip3Aa en H. virescens, alcanzando un nivel de resistencia > 2300 veces mayor en la décima generación. Es importante hacer notar que esta rápida evolución de la selección en condiciones de laboratorio contrasta con los resultados obtenidos con las proteínas Cry1, tanto en nuestro trabajo como por otros autores: una la población de O. furnacalis adquirió un nivel de resistencia a Cry1Ab de alrededor de 100 veces sólo después de 35 generaciones de selección; de manera similar, una población de O. nubilalis desarrolló una resistencia de más de 3000 veces a Cry1F después de 35 generaciones de selección. Esta diferencia en respuesta a la selección, además de reflejar una frecuencia mucho mayor de alelos de resistencia para Vip3Aa, puede sugerir diferencias en los mecanismos de resistencia a las proteínas Vip3Aa y Cry1, lo cual queda en evidencia cuando se estudia la unión de Vip3A a BBMV de insectos resistentes El análisis de la unión de 125I-Vip3Aa a BBMV de larvas de M. separata tanto de insectos susceptibles y resistentes no reveló ninguna diferencia de unión, ya sea cualitativa o cuantitativa. Los resultados sugieren que la unión alterada a los receptores de la membrana del intestino medio no es el principal mecanismo de resistencia a la proteína Vip3Aa. Numerosos estudios han demostrado que la alteración de los receptores de membrana es un mecanismo evolutivo común que confiere altos niveles de resistencia a las proteínas Cry, pero nunca se ha establecido su relación con la resistencia a Vip3A. Las diferencias de unión cualitativas o cuantitativas entre insectos susceptibles y resistentes están en línea con los resultados anteriores con otras cepas resistentes a Vip3Aa de otras especies de insectos para las que no se encontraron diferencias de unión a Vip3Aa. Otros estudios han encontrado una activación más lenta de Vip3Aa por el jugo del intestino medio de las larvas de H. armigera en insectos resistentes a Vip3Aa comparados con los insectos susceptibles, aunque estas pequeñas diferencias no parecen ser la razón principal de los altos niveles de resistencia en dicha cepa. En otro estudio, larvas de H. virescens resistentes a Vip3Aa mostraron niveles drásticamente reducidos de fosfatasa alcalina unida a la membrana, pero no se pudo demostrar su participación en la resistencia. Por lo tanto, a diferencia de las proteínas Cry, la unión alterada a los receptores de membrana no parece ser el principal mecanismo de resistencia a las proteínas Vip3Aa, y deben explorarse otros mecanismos, tales como cambios en otros pasos en el modo de acción de Vip3Aa, ya sea antes (como la activación por proteasas o el secuestro de la toxina por la matriz peritrófica) o después (formación de poros, transducción de señales, apoptosis, ruptura de mitocondrias, etc.) de la unión a la membrana. Estos resultados sugieren que los alelos para la resistencia a Vip3Aa parecen ser relativamente comunes y, por lo tanto, el uso de proteínas Vip3A solas, sin combinarlas con proteínas Cry, no es una estrategia adecuada para la implementación a largo plazo de esta tecnología en el control de plagas. La acción sinérgica encontrada para algunas combinaciones de proteínas Vip3Aa y Cry1 también favorece el uso combinado de estos dos tipos de proteínas insecticidas para un uso mejor y más prolongado de la tecnología de cultivos Bt. En conclusión, en esta tesis analizamos el potencial insecticida de varias proteínas Vip3 y Cry, e intentamos ver la mejor estrategia de su uso combinado (o estrategia piramidal) en cultivos Bt. Los resultados de este estudio serán una referencia importante para subsiguientes desarrollos y aplicaciones de formulaciones de productos basados en Bt, así como los cultivos Bt. Además, los resultados de la identificación del mapa de cinco dominios de la proteína Vip3Af son importantes para entender la relación estructura-función de las proteínas Vip3. Los dominios I a III se han identificado como críticos para mantener el tetrámero y la unión específica a BBMV, que son fundamentales para arrojar luz sobre el modo de acción de las proteínas Vip3. Estos resultados han contribuido a la elucidación de su estructura 3D. Además, la mutación M34L podría incrementar la actividad insecticida, y la identificación de que el residuo 483 ha de ser un residuo ácido, mientras que el 552 un residuo aromático, nos abren la puerta a mejorar la actividad de las proteínas Vip3 mediante ingeniería genética teniendo en cuenta estas limitaciones. Los estudios de unión ligando-receptor, especialmente los de competencias heterólogas, han permitido elaborar un “modelo de receptores” que pone de manifiesto la no utilización conjunta de sitios de unión por las proteínas Cry1 y Vip3. El estudio de la resistencia cruzada llevado a cabo con cepas resistentes está del todo de acuerdo con nuestro “modelo de receptores”, en cuanto que no se ha encontrado resistencia cruzada entre proteínas Cry y Vip3. En general, los resultados de esta tesis contribuirán de manera importante al futuro uso y aplicación de las proteínas Vip3 para el beneficio de la agricultura y el medio ambiente. The improvement in the performances of global agricultural or food systems significantly affects by the control of pests and pathogens. The more healthy, environmental and sustainable integrated pest management (IPM) strategies are demanded in the modern agriculture. One of the most important strategy or biotechnology rely on Bacillus thuringiensis (Bt) and its secreted insecticidal proteins has been the most economically successful use to control pests to date. Recently, a new subfamily of vegetative insecticidal proteins (Vip3) produced during the vegetative growth phase of Bt was considered as the combined use with the other Bt proteins, especially that have been reported evolving distinct resistant (Cry toxins) with long-term commercial use. Despite Vip3 proteins have been revealed that no sequence or homology similarity with Cry proteins and are toxic to a wide variety of Lepidoptera, its mode of action is yet not completely elucidated. To better apply and understand the Vip3 proteins, in this doctoral we investigate the potential interaction of combination use (insecticidal spectrum, cross resistance, interaction), then we analyze the critical residues on the structure and toxicity through mutagenesis, and use these critical mutations to shed the light on the mode of action of Vip3 proteins. Firstly we investigate ten Bt toxins (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ah, Cry1Fa, Cry2Aa, Cry2Ab, Cry1Ie, Vip3Aa19, Vip3Aa16, and Vip3Ca) toxicities and their combination of use at lab against Mythimna separata, which is a destructive pest of agricultural crops in East Asia. The bioassays results revealed that LC50 (lethal concentration for 50% mortality) values (Cry1Ac/Vip3Aa19/Vip3Ca 3061-fold) M. separata strain was rapidly obtained after 8 or 9 generations, no remarkable Cry1Ab or Cry1F resistance was observed at the same selected time. Analysis of the difference of labeled 125I-Vip3Aa binding to BBMVs from larvae from the susceptible and resistance insects revealed no any qualitative or quantitative binding difference. It suggests that altered binding to midgut membrane receptors is not the main mechanism of resistance to Vip3Aa protein. The results we obtained are helpful to the applied strategy of Bt toxins and give to a better understanding of the protein structure and function of Vip3A proteins, which will be guided for the strategies in pest management or resistance management. In addition, the identification of the binding domains of Vip3A is so critical to shed light on the mode of action of Vip3 proteins.