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Biogénesis e inserción en membranas de proteínas de movimiento de virus vegetales

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La propagación de una infección viral en plantas está mediada por unasproteínas codificadas por el propio virus denominadas proteínas de movimiento(MP). Estas proteínas unen el genoma viral de forma cooperativa y sinespecificidad de secuencia, formando unos complejos RNA-MP, que se asocian,en la mayoría de casos, al retículo endoplasmático (RE) para ser transportadosmuy posiblemente a través del citoesqueleto hacia los plasmodesmos, canalesmembranosos que interconectan las células en plantas. Una vez estos complejosalcanzan los plasmodesmos, el RNA viral es translocado a las célulasadyacentes a través de un mecanismo todavía desconocido.A pesar de la variabilidad entre las distintas familias virales en elnúmero y tamaño de este tipo de proteínas, se ha descrito que muchas de estasMPs interaccionan con las membranas celulares. Sin embargo, la naturaleza deesta interacción y los mecanismos que subyacen a este fenómeno no se hanexplorado todavía. Así pues, el objetivo central de la presente tesis se ha basadoen el estudio y caracterización de la asociación de estas proteínas con lamembrana del RE. El virus objeto de estudio ha sido el Virus del Moteado delClavel, que codifica dos MPs, p7, una proteína soluble capaz de unir el genomaviral y p9, que presenta dos regiones hidrofóbicas susceptibles de interaccionarcon las membranas celulares.En primer lugar, mediante experimentos de transcripción/traducción invitro se ha demostrado que p9 es una proteína integral de membrana quecontiene dos fragmentos transmembrana y adopta una orientación N-/Cterminalcitoplasmática.En segundo lugar, se ha caracterizado el mecanismo a través del cual p9alcanza las membranas celulares. Los resultados obtenidos demuestran que lainserción de p9 tiene lugar de forma co-traduccional y es dependiente de SRP,un complejo ribonucleoproteico que, en general, participa en eldireccionamiento de proteínas a la membrana del RE. Además, el virus explotala propia maquinaria celular responsable de la integración de las proteínas demembrana celulares. Así, el complejo Sec61 y la proteína TRAM participan en elproceso de inserción de p9. Entre los resultados obtenidos cabe destacar que (i)los segmentos transmembrana de este virus se integran en la membrana através de un mecanismo secuencial y ordenado desde Sec61a a TRAM; y (ii) laproteína TRAM media la integración de esta proteína viral desempeñando unaposible función de reclutamiento de segmentos transmembrana antes de queéstos particionen conjuntamente a la bicapa lipídica, una vez completada latraducción de la proteína.Finalmente, se ha realizado un estudio de los determinantes topológicosde la proteína que determinan su orientación en la membrana. Se ha exploradola contribución de toda una serie de parámetros, que se han establecido comodeterminantes en el caso de proteínas de membrana de procariotas o eucariotas.Entre estos factores se encuentran la presencia de residuos cargados en lasecuencia de la proteína, la hidrofobicidad de los fragmentos transmembrana, lalongitud de dominios extramembranosos y/o la presencia de residuosaromáticos en las regiones flanqueantes de los propios segmentostransmembrana. Los resultados demuestran que la proteína viral p9 presenta lainformación topológica distribuida a lo largo de la secuencia de aminoácidos dela proteína. Esta estrategia impediría que la posible aparición de una mutaciónno conservativa en el gen de la proteína, proceso muy habitual durante lareplicación de los genomas virales, alterara la orientación de la proteína en lamembrana y en definitiva, comprometiese su función biológica.