6533b83afe1ef96bd12a7e38

RESEARCH PRODUCT

FRET fluorescento proteīnu balstītu pH sensoru izveide

subject

description

Iekššūnas vides pH ir būtisks parametrs, kas raksturo šūnā notiekošos procesus, kā arī šūnas vitalitāti. Fluorescento proteīnu pielietošana pH noteikšanai ir daudzsološa metode. Pieejami atšķirīgas pH jutības fluorescentie proteīni, tie neuzrāda augstu toksicitāti un invazivitāti, padarot tos piemērotus dzīvu šūnu pētījumiem. Maģistra darba mērķis bija izveidot fluorescento proteīnu saturošus konstruktus ar atšķirīgu pH jutības slieksni, izmantojot Aquamarine, ECFP, EYFP un Citrine fluorescentos proteīnus, kas darbosies kā pH sensoru sistēma dzīvās šūnās, izmantojot FRET metodi. Trīs konstrukciju izveide (pAqua-HL3-Citrine, pAqua-HL3-EYFP, pECFP-HL3-EYFP) veikta ar dažādām metodiskajām pieejām. Pielietota vairāku fragmentu vienlaicīga ligēšana un ķīmiski sintezēta fragmenta izmantošana, kurš satur fluorescento proteīnu gēnus, ar un bez tā amplifikācijas pirms ligēšanas. Vairāku fragmentu ligēšanas rezultātā konstrukcija neizveidojās, savukārt ķīmiski sintezētais fragments veiksmīgi ieligējās vektorā un tika iegūtas rekombinantas E.coli baktēriju kolonijas. Sekvencēšanas rezultāti liecina, ka gēnu konstrukta sintēzes produktu nav ieteicams amplificēt mutāciju rašānās dēļ PĶR laikā. Izveidoto konstruktu fluorescences pārbaude plašā lauka mikroskopā norādīja uz traucētu gēna ekspresiju. Secinājums: Izveidoto konstrukciju analīze liecina par atsevišķu plazmīdu reorganizāciju transformācijas rezultātā. Turpmāk paredzēts veikt baktēriju koloniju PĶR un restrikcijas analīzi, pareizi izveidota konstrukta identificēšanai.