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Impacto de los miomas intramurales en la receptividad endometrial

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Existen una gran cantidad de factores que pueden contribuir a la infertilidad, desde infecciones o factores ambientales a factores genéticos e incluso relacionados con la dieta. Estos factores pueden afectar a la mujer, al hombre o a ambos, resultando en la incapacidad para conseguir un embarazo o para que dicho embarazo llegue a término. El factor masculino contribuye al 30-55% de todos los casos de infertilidad (Lee y Foo, 2014). El resto, se debe a infertilidad femenina, donde se sospecha que una de las principales causas de la infertilidad de origen desconocido (hasta un 40% de las causas de infertilidad de origen femenino) sea de origen endometrial (Healy y cols., 1994). La compleja fisiología del endometrio se puede ver alterada por multitud de factores, malformaciones anatómicas, patologías diversas y variaciones endocrinas que pueden conducir a una alteración de la función endometrial (Abrao y cols., 2013). Una de las patologías relacionadas con la disminución de la implantación embrionaria es la presencia de miomas, tumores benignos que pueden alterar el ambiente molecular y fisiológico del endometrio, afectando a la migración espermática, la implantación embrionaria, y, por supuesto, a la receptividad endometrial; con una incidencia del 25-30% de las mujeres en edad reproductiva (Vitale y cols., 2013). Se han propuesto varios mecanismos por los cuales se asocia la presencia de miomas submucosos con infertilidad o subfertilidad: se cree que los miomas pueden interferir con la migración del esperma y el transporte de óvulos por el bloqueo mecánico de las zonas distales o proximales de los tubos de Falopio; y pueden afectar al proceso de implantación embrionaria a través de la alteración de la cavidad uterina causando presión mecánica o generando contracciones uterinas anormales, y causando desórdenes vasculares en el endometrio, secreción de sustancias vasoactivas y, en general, una función endometrial alterada (Parker 2007). Varios estudios retrospectivos y de caso-control han demostrado que los miomas submucosas e intramurales que penetran en la cavidad endometrial están asociados con peores tasas de embarazo y de implantación, pero que su eliminación mejora las tasas de embarazo (Abrao y cols., 2013). Sin embargo, el impacto en la infertilidad de los miomas intramurales o subserosos más pequeños que no alteran la cavidad endometrial es controversial (Brady y cols., 2013). Se ha estudiado el impacto de estos miomas en la implantación embrionaria y la receptividad endometrial mediante el análisis de distintos marcadores moleculares (Sinclair y cols., 2011), el análisis de expresión génica diferencial entre muestras de miomas y de endometrio de mujeres sanas (Horcajadas y cols., 2008), y mediante estudios prospectivos y retrospectivos en clínicas de reproducción asistida. Algunos autores han encontrado una reducción de la implantación y los embarazos en curso en presencia de miomas intramurales pequeños (7,5 en el bioanalizador de Agilent). En total, se analizaron 19 muestras por duplicado: seis del grupo A, seis del grupo B y siete del grupo C. 2. Marcaje, hibridación y lectura del microarray La generación de las dianas de ADNc marcadas y la hibridación del chip se llevó a cabo siguiendo el método recomendado por el fabricante. La señal de fluorescencia en los microarrays se adquirió usando un escáner de microarray Genepix 4100 (Axon Instrument, Foster City, CA). Las imágenes escaneadas se procesaron usando el software GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments). Los datos generados por el análisis CodeLink Operating Software (Northbrook, IL) de las imágenes escaneadas del microarray fueron importados en la versión 4.0 del Set de Análisis de Patrones de Expresión Génica (GEPAS, Valencia, España) para su análisis. Los archivos que contenían los niveles de intensidad de las sondas fueron procesados usando el algoritmo robusto de análisis de microarrays para el ajuste de la señal de fondo, la normalización y la transformación log2 de los valores perfectamente emparejados. La intensidad de los puntos de todos los microarrays estaba entre los valores estándar para los bioarrays Codelink de todo el genoma. La extracción de datos fue realizada de 0 a 65.535 unidades arbitrarias. ii. Análisis de datos 1. Análisis bioinformático El análisis de microarray se llevó a cabo usando la versión 3.1 de GEPAS (http://www.gepas.org) (Vaquerizas y cols., 2005). La anotación funcional de los resultados de los análisis se hizo usando el sitio Babelomics (http://www.babelomics.org). 2. Preprocesado Los datos que se extrajeron del proceso de normalización del microarray se preprocesaron antes de llevar a cabo el análisis del microarray. Múltiples sondas que mapean el mismo gen fueron mezcladas usando la media como resumen de los valores de hibridación. 3. Agrupamiento de muestras Se usó el método SOTA para agrupar perfiles de expresión diferentes. SOTA se incluye dentro de GEPAS (Vaquerizas y cols., 2005). Para la visualización y la evaluación de la calidad de los clusters o grupos, usamos CATT, un módulo de GEPAS. El enriquecimiento funcional de los grupos se estudió con la herramienta FatiGO+ (Al-Shahrour y cols., 2004; Al-Shahrour y cols., 2007). 4. Expresión génica diferencial Se aplicó un test-T para encontrar diferencias en la expresión principal en los tres grupos de microarrays (clases). Se analizaron los patrones de expresión génica de las muestras en cada grupo, obteniendo un p-valor para cada gen en el experimento. También aplicamos un test-T a los grupos. Los p-valores se corrigieron usando el índice de falsos positivos (Benjamini y Hochberg, 1995) para considerar los efectos de múltiples tests. 5. Análisis funcional Para detectar activaciones o desactivaciones en funciones biológicas o vías de señalización, empleamos FatiScan (Al-Shahrour y cols., 2007b), una variante del algoritmo de enriquecimiento de set de genes que detecta de manera significativa la regulación positiva o negativa de bloques de genes relacionados funcionalmente en listas de genes ordenados por expresión diferencial. FatiScan es una parte del sitio Babelomics. FatiScan puede buscar bloques de genes que están relacionados funcionalmente por diferentes criterios como términos de ontología génica, vías Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, y otros. 6. Validación de microarray: PCR cuantitativa Para verificar los resultados obtenidos del microarray, se llevó a cabo una PCR a tiempo real para seis genes seleccionados: dos regulados positivamente, inhibidor 2 de la vía del factor de tejido (TFPI2) y el miembro 4 de la familia transmembrana 4 L seis (TM4SF4); y cuatro regulados negativamente, glutatión peroxidasa 3 (plasma) (GPx3), claudina 10 (CLDN10), regulador 2 del transporte de iones que contiene el dominio FXYD (FDXY2), y fosfoproteína secretada 1 (osteopontina, sialoproteína ósea I, activación temprana de linfocitos T 1) (SPP1). El análisis estadístico de los datos de PCR se realizó usando el algoritmo del software de expresión relativa, el cual usa una redistribución por parejas y un test aleatorizado para determinar la significancia. b. Estudio retrospectivo: i. Análisis estadístico de datos clínicos Se hizo un cálculo de la potencia de contraste con la hipótesis inicial de que la presencia de miomas podía reducir las tasas de gestación un 20%. Teniendo en mente que los índices de embarazo son de alrededor del 50% en nuestro programa FIV (riesgo=50%) y que el efecto de los miomas puede ser sobre el 20% (diferencia de riesgo=20%), el tamaño estimado de muestreo con riesgo-β del 20% (potencia=80%) y riesgo-α del 5%, debería haber más de 93 pacientes por grupo. Se realizó un ANOVA por comparación entre los seis grupos establecidos, a pesar de que la mayoría de las variables no siguieron una distribución normal. Sin embargo, ninguna de ellas presentó una asimetría importante y seguían el teorema central del límite. Se usaron tests χ2, seguidos de corrección de Bonferroni (multiplicando el P-valor por el número de comparaciones realizadas) para comparar los índices de embarazo y de aborto entre los grupos. También realizamos un análisis de regresión logística en el que se cuantificó el efecto del tamaño de los miomas en las tasas de embarazo y de aborto. Se calculó la significancia del modelo por el test Omnibus (razón de probabilidad) y la incertidumbre explicada por el modelo se evaluó por Negelkerke R2. La razón de momios o de oportunidades (OR) del efecto de un cm más en el tamaño de mioma en el resultado del embarazo se expresa junto con intervalos de confianza (CIs) del 95%, R2 y significancia. Se asumió una significancia de p<0,05. El análisis estadístico se realizó usando el Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales 14 (SPSS Inc., Chicago, IL).