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Influencia de la estimulación ovárica durante un tratamiento de fecundación in vitro en la incidencia de aneuploidías embrionarias

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La baja fecundidad humana podría deberse a la alta incidencia de anomalías cromosómicas embrionarias que justifica que hasta un 70% de las concepciones espontáneas no lleguen a término. La elevada tasa de aneuploidías observada en tratamientos de Fecundación in vitro (FIV) podría ser inherente a la especie humana o estar relacionada con los procedimientos derivados de la técnica, como las condiciones de cultivo in vitro o la estimulación ovárica (EO). Se ha especulado que esta última pudiera interferir con la selección natural de los ovocitos de buena calidad o que concentraciones suprafisiológicas de gonadotrofinas alteraran la maduración nuclear y la resunción de la meiosis conduciendo a la génesis de embriones aneuploides. HIPÓTESIS: La EO aumenta la incidencia de aneuploidías en embriones humanos cuando la edad no influye de forma decisiva en la misma. OBJETIVOS: Comprobar si la EO conlleva a la generación de un mayor porcentaje de aneuploidías embrionarias en mujeres jóvenes, a través de un doble análisis comparativo entre: (1) proporción de embriones con aneuploidias en un ciclo no estimulado con la observada en un ciclo estimulado (comparación global entre ambos ciclos) y (2) media del porcentaje de embriones aneuploides por sujeto en cada uno de los ciclos (comparación intrasujeto entre ambos ciclos). Objetivos secundarios: porcentaje de embriones euploides por ovocito MII obtenido en ambos tipos de protocolos, relacionar respuesta ovárica y dosis de gonadotropinas con número absoluto de embriones euploides y aneuploides, tasa de aneuploidías, eficacia de ambos protocolos y comprobar la fiabilidad de nuestra técnica FISH, entre otros. MATERIAL Y MÉTODO: Estudio prospectivo de cohortes con comparación intra-sujeto de la incidencia de aneuploidías tras un ciclo no estimulado (CNE) y un posterior ciclo estimulado (CE) realizados en un periodo máximo de 3 meses. El estudio se llevó a cabo en ciclos de donación ovocitaria y espermática, para excluir cualquier factor que pudiera incrementar el riesgo de aneuploidías, como edad materna avanzada, problemas relacionados con la infertilidad o factor masculino severo. En el CNE la única medicación administrada consistió en la inyección de coriogonadotropina recombinante (rCG) cuando el folículo preovulatorio alcanzó 18mm diámetro. El CE fue llevado a cabo con agonistas de la GnRH en protocolo largo y estimulación ovárica convencional con dosis moderadas de 150UI de FSHrec y 75 UI de hp-hMG, hasta observar ecográficamente la presencia de ≥ 6 folículos > 17 mm, cuando se administró la inyección de rCG. En ambos protocolos, la punción folicular se realizó a las 36 horas de la inyección de rCG. El diagnóstico genético preimplantacional (DGP) fue llevado a cabo mediante la biopsia de una blastómera en dia 3 de desarrollo embrionario y protocolo de FISH secuencial para el despistaje de aneuploidías de 9 cromosomas. Con el fin de validar la fiabilidad de nuestro diagnóstico en dia 3, 36 embriones seleccionados aleatoriamente fueron reanalizados en dia 5 mediante FISH, observando una tasa de confirmación del 91,7%. RESULTADOS: 185 donantes candidatas fueron inicialmente reclutadas, de las que 51 llegaron a completar el CNE (ciclo completo: con DGP realizado). De ellas, 46 completaron igualmente el CE. En estas 46 donantes se analizaron 46 embriones en el CNE y 307 (303 informativos) en el CE. La proporción de embriones aneuploides en el CNE fue de 34,8% y en el CE de 40,6%, con un riesgo relativo de 1,17 (IC 95%: 0,77-1,77) (p=0,454). La comparación intrasujeto muestra una tasa de aneuploidias del 34,8% y del 38,2%, respectivamente, con una odds ratio de 1,10 (IC 95%: 0,50-2,41) (p=0,64). No se dieron diferencias significativas en el porcentaje de embriones euploides por MII obtenido entre ambos grupos de estudio (33,7% vs. 29,1%, p=0,38), ni en la tasa de implantación de las pacientes receptoras de gametos (39,3% vs. 31,3%, p=0,68). Las tasas de recién nacido vivo por transferencia (21,4% vs. 47,7%, p=0,047) y de recién nacido vivo acumulada por ciclo completado (13% vs. 60,9%, p0,05). No se observación diferencias significativas en la distribución del tipo de anomalías cromosómicas ni respecto al tipo de cromosoma afecto. DISCUSIÓN: La hipótesis inicial queda refutada al observar cómo en mujeres jóvenes la EO no incrementa significativamente la incidencia de aneuploidías cuando comparamos la misma en el CNE y en el CE en la misma mujer. Este es el primer estudio que ha llevado a cabo la comparación intrasujeto, evitando de este modo los sesgos derivados de las variaciones interpaciente y de la diferencia temporal entre la realización de un ciclo y otro. Este hecho permitió valorar exclusivamente el efecto neto de las gonadotropinas sobre las aneuploidías ya que ambos ciclos de FIV eran exactamente iguales con la única diferencia en el uso o no de gonadotropinas (a excepción de la rCG, empleada en ambos ciclos). Es por ello que utilizamos a la misma mujer como control de si misma, así como el mismo donante de semen en ambos ciclos. Además, los medios de cultivo, las condiciones del laboratorio y el personal del laboratorio de FISH-PGS fueron idénticos en ambos ciclos, así como las técnicas de manipulación de gametos y de biopsia embrionaria. Un valor añadido del presente trabajo es que ha incluido el tamaño muestral más grande hasta la fecha que ha analizado el estatus cromosómico de embriones procedentes de CNE, es decir, sin el influjo de las gonadotrofinas exógenas sobre el desarrollo folicular. Nuestros resultados muestran que en mujeres sanas, jóvenes, fértiles y sin antecedentes de EO, aproximadamente un tercio de los embriones procedentes de un ciclo no estimulado son cromosómicamente anormales. Ello significa que la incidencia de aneuploidías embrionarias en la especie humana no es desdeñable, y ello explicaría la baja fecundidad observada en humanos. De acuerdo con los resultados observados en nuestro estudio, la EO debería llevarse a cabo de manera moderada, ya que es de este modo como hemos observado que no se incrementa de forma significativa la tasa de aneuploidías con respecto al CNE, no pudiendo aseverar que una estimulación ovárica agresiva con la utilización de 300UI diarias o más de gonadotropinas puedan incrementar o no las aneuploidías embrionarias. Queda también por dilucidar si estos hallazgos son aplicables a mujeres con antecedentes de infertilidad. CONCLUSIONES: 1) El uso de dosis moderadas de gonadotropinas para la Estimulación Ovárica durante un ciclo de FIV no incrementa de forma estadísticamente significativa la tasa de aneuploidías embrionarias con respecto al ciclo no estimulado. 2) Los resultados derivados del análisis de ciclos no estimulados para FIV en este estudio muestran que las alteraciones cromosómicas embrionarias humanas están presentes incluso en condiciones ováricas fisiológicas y en ausencia de estimulación con gonadotropinas, sugiriendo la causa de la baja fecundidad en humanos en un ciclo menstrual único. 3) En mujeres jóvenes y fértiles, como las donantes de ovocitos, una mayor respuesta ovárica ante una misma dosis moderada de gonadotropinas, ofrece un mayor número absoluto de embriones euploides por ciclo iniciado. 4) La tasa de aneuploidías observada en este grupo de mujeres no se correlaciona directamente con la respuesta ovárica ni con la dosis total de gonadotropinas administradas. 5) El número de ovocitos metafase II necesario para dar lugar a un embrión euploide es similar en el ciclo no estimulado y en el ciclo estimulado. 6) A pesar de que las tasas de implantación son comparables en ambos ciclos, en el ciclo estimulado existe una mayor tasa de gestación acumulada gracias a la disponibilidad de un mayor número de embriones euploides para transferir al útero materno. INTRODUCTION: Poor human fertility could be due to a high incidence of embryo chromosome anomalies that justify up to 70% of spontaneous conceptions not being full-term. The high rate of aneuploidies observed in in vitro fertilisation (IVF) treatments could be inherent to the human species or be associated with procedures relating to the technique; e.g., the in vitro culture conditions or controlled ovarian stimulation (COS). It has been speculated that COS could interfere with the natural selection of good quality oocytes or that supraphysiological concentrations of gonadotrophins alter nuclear maturity and the resumption of meiosis, leading to the genesis of aneuploid embryos. HYPOTHESIS: COS increases the incidence of aneuploidies in human embryos when age has no decisive influence. OBJECTIVES: To check whether COS entails a higher percentage of embryo aneuploidies in young women by a twofold comparative analysis: (1) proportion of embryos with aneuploidies in a non-stimulated cycle vs. the proportion observed in a stimulated cycle (global comparison between both cycles); (2) mean percentage of aneuploid embryos per subject in both cycles (intrasubject comparison between both cycles). Secondary objectives (among others): percentage of euploid embryos per MII oocyte obtained in both protocol types, relate ovarian response and dose of gonadotrophins with the absolute number of euploid and aneuploid embryos, rate of aneuploidies, efficiency of both protocols; check the reliability of our FISH technique. MATERIAL AND METHODS: A prospective cohort study with an intrasubject comparison of the incidence of aneuploidies after a non-stimulated cycle (NSC) and a subsequent stimulated cycle (SC) over a maximum 3-month period. This study was carried out in ovary and sperm donation cycles to exclude any factor that could increase the risk of aneuploidies; e.g., advanced maternal age, infertility and severe masculine factor problems. In the NSC, the only administered medication was an injection of recombinant choriogonadotrophin (rCG) when the preovulatory follicle reached a diameter of 18 mm. The SC was carried out with GnRH agonists in long protocol IVF and conventional COS was done with moderate doses of 150 IU of FSHrec and 75 IU of hp-hMG until ≥ 6 follicles > 17 mm were seen in an ultrascan, which was when an rCG inyection was administered. In both protocols, follicular punction was performed 36 h after the rCG injection. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) was made by doing a blastomere biopsy on day 3 of embryo development and following a sequential FISH protocol to mislead 9-chromosome aneuploidies. In order to validate the reliability of our diagnosis on day 3, 36 aleatorily selected embryos were re-analysed on day 5 by FISH, with a confirmation rate of 91.7%. RESULTS: 185 candiate donors were initially recruited of whom 51 completed the NSC (complete cycle: with PGD made). Of the 51, 46 also completed the SC. From these 46 donors, 46 embryos were analysed in the NSC and 307 (303 informative ones) in the SC. The proportion of aneuploid embryos was 34.8% in the NSC and 40.6% in the SC, with a relative risk of 1.17 (95%CI: 0.77-1.77) (p=0.454). The intrasubject comparison gave a rate of aneuploidies of 34.8% and 38.2%, respectively, with an odds ratio of 1.10 (95%CI: 0.50-2.41) (p=0.64). No significant differences in the obtained percentage of euploid embryos by MII were seen between the study groups (33.7% vs. 29.1%, p=0.38), or for the implantation rate for recipient patients (39.3% vs. 31.3%, p=0.68). The rates of live newborns by transfer (21.4% vs. 47.7%, p=0.047) and of live newborns accumulated per completed cycle (13.0% vs. 60.9%, p0.05). No significant differences were found in the distribution of the type of chromosomal anomalies or in the affected chromosome. DISCUSSION: Initially, the hypothesis was refuted when COS did not significantly increase the incidence of aneuploidies in young women when comparing it in the NSC and the SC in the same woman. This is the first study to have made an intrasubject comparison to avoid biases deriving from interpatient variations and the time difference between the performance of one cycle or another. This allowed us to exclusively assess the net effect of gonadotrophins on aneuploidies as both IVF cycles were exactly the same, save one difference: use, or not, of gonadotrophins (except rCG, employed in both cycles). For this reason, we employed the same woman as a control of herself, as well as the same semen donor in both cycles. Moreover, the culture means, the laboratory conditions, the FISH-PGS laboratory personnel, and the gamete handling and embryo biopsy techniques were identical in both cycles. One added value of the present work is that it includes the largest sample size used to date to analyse the chromosomal status of embryos from the NSC; that is, with no influx of exogenous gonadotrophins on follicle development. Our results show that in young, healthy, fertile women with no COS background, approximately one third of the embryos from an NSC are chromosomally abnormal. This means that the incidence of embryonic aneuploidies in humans is far from negligible and would explain the low fertility observed in humans. In accordance with the results obtained in our study, COS should be used moderately because, as seen, the rate of aneuploidies does not significantly increase if compared with the NSC, and it was not possible to assert that aggressive COS, using 300 IU/day of gonadotrophins or more, would increase embryonic aneuploidies or not. It is necessary to elucidate whether these findings can be applied to women with a background of infertility. CONCLUSIONS: 1) The use of moderate doses of gonadotrophins for COS in an IVF cycle does not significantly increase the rate of embryo aneuploidies vs. NSC statistically. 2) The results of analysing NSCs for IVF herein shows that human chromosomal embryo alterations are present even under physiological ovary conditions and when stimulation with gonadotrophins is lacking, which suggests the cause of poor fertility in humans in a single menstrual cycle. 3) In young, fertile female oocyte donors, a greater ovarian response to the same moderate dose of gonadotrophins offers a larger absolute number of euploid embryos per initiated cycle. 4) The rate of aneuploidies observed in this group of women does not correlate directly with ovarian response or with the total doses of gonadotrophins administered. 5) The number of MII oocytes required to give rise to a euploid embryo is similar in both the NSC and SC. 6) Despite the implantation rates being comparable in both cycles, a higher accumulated rate of pregnancy exists in the SC thanks to a larger number of euploid embryos available to be transferred to the maternal uterus.