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RESEARCH PRODUCT

A Spinal Muscular Atrophy Reporter System for in vivo Drug Discovery in Drosophila melanogaster

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Fondo La Atrofia Muscular Espinal es un desorden neuromuscular raro y fatal causado por la pérdida o reducción en los niveles de proteína de la Neurona Motor de Supervivencia (SMN). Los individuos afectados tienen el gen SMN1 mutado y la copia SMN2 específica de humanos no afectada, que se traduce solo parcialmente en una proteína SMN funcional. La activación farmacológica de la inclusión del exón 7 de SMN2 por moléculas pequeñas o oligonucleótidos antisentido modificados es un enfoque prometedor para tratar la SMA. Obtener nuevos compuestos potencialmente terapéuticos para los ensayos clínicos es un proceso largo y costoso. El enfoque de reposicionamiento de medicamentos puede reducir el tiempo de transición de la detección a pruebas en humanos, especialmente cuando se realiza en un organismo completo como Drosophila melanogaster. Resultados Aquí describimos un sistema reportero, basado en el minigen SMN2 (Zhang, Lorson et al., 2001), informativo de la modulación del empalme del exón 7 en las neuronas motoras de Drosophila. La inclusión del exón 7 da como resultado la traducción de la luciferasa funcional y la detección de luminiscencia. Cuanto mayor es la tasa de inclusión, más fuerte es la señal, que se ha confirmado alimentando las moscas con compuestos conocidos por promover el empalme de una transcripción de longitud completa. La barrera hematoencefálica de Drosophila, altamente conservada, hace que el cribado sea selectivo para los compuestos con la capacidad de dirigirse al sistema nervioso central. Este modelo de evaluación se utilizó para evaluar 1100 medicamentos de Prestwick Chemical Library, con una tasa de éxito del 2,5%. Los 11 fármacos más prometedores se analizaron en fibroblastos derivados de pacientes SMA y 3 de ellos aumentaron significativamente los niveles de proteína SMN. El mejor resultado (GT5) se validó y las células se trataron con la concentración máxima de GT5 no tóxica (50 μM) durante 72 h. El fármaco aumentó significativamente la transcripción de SMN2 de longitud completa y los niveles de proteína SMN de una manera dependiente de la dosis. Las imágenes de inmunofluorescencia SMN de fibroblastos derivados de pacientes SMA, tratados con GT5, confirman claramente el aumento del nivel de proteína SMN, en comparación con las células tratadas con disolvente. Conclusiones Desarrollamos un sistema spliceosensor SMN2 basado en Drosophila capaz de detectar compuestos que afectan al minigen en las neuronas motoras de la mosca. Uno de los éxitos seleccionados, denominado GT5, demostró aumentar significativamente los niveles de proteína SMN en fibroblastos derivados de SMA-paciente. Background Spinal Muscular Atrophy is a rare and fatal neuromuscular disorder caused by the loss or reduction in the Survival Motor Neuron (SMN) protein levels. The affected individuals have mutated SMN1 gene and unaffected human-specific SMN2 copy, which is only partially translated into a functional SMN protein. Pharmacological activation of SMN2 exon 7 inclusion by small molecules or modified antisense oligonucleotides is a promising approach to treat SMA. Getting new, potentially therapeutic, compounds to clinical trials is a long and expensive process. Drug repositioning approach can reduce the transition time from screen to human tests, especially when undertaken in a whole organism like Drosophila melanogaster. Results Here we describe a reporter system, based on the SMN2 minigene (Zhang, Lorson et al. 2001), informative of exon 7 splicing modulation in Drosophila motor neurons. The inclusion of exon 7 results in translation of functional luciferase and luminescence detection. The higher the inclusion rate the stronger the signal, which has been confirmed by feeding the flies with compounds known to promote splicing of a full-length transcript. The highly conserved Drosophila blood-brain barrier makes the screening selective to compounds with the ability to target central nervous system. This screening model was used to test 1100 drugs from Prestwick Chemical Library, with a 2.5% hit rate. The 11 most promising drugs were tested in SMA patient-derived fibroblasts were 3 of them significantly increased the SMN protein levels. The best hit (GT5) was further validated and cells were treated with the maximal non-toxic GT5 concentration (50 µM) for 72 h. The drug significantly increased the full-length SMN2 transcript and SMN protein levels in a dose-dependent manner. The SMN immunofluorescence images from SMA patient-derived fibroblasts, treated with GT5, clearly confirm the increase of SMN protein level, compared to solvent treated cells. Conclusions We developed a Drosophila-based SMN2 spliceosensor system capable of detecting compounds that affect the minigene in fly motor neurons. One of the selected hits, named GT5, proved to significantly increase the SMN protein levels in SMA-patient derived fibroblasts.