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Transcriptomic analysis of host-pathogen relationship in Vibrio vulnificus

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Vibrio vulnificus es un patógeno bacteriano que habita en ecosistemas costeros de salinidades intermedias localizados en zonas del planeta templadas y cálidas. Esta especie es una de las más sensibles al calentamiento global habiendo experimentado una expansión en su distribución geográfica hacia zonas costeras de aguas frías como las que rodean países tan próximos al círculo polar como como Noruega y Groenlandia, de las que se aísla en las épocas cálidas del año. En su medio natural la bacteria puede encontrarse en un estado metabólico inactivo, conocido como estado VBNC (viable but not culturable) que es inducido en circunstancias ambientales adversas (temperaturas por debajo de 10ºC, salinidad menor al 0,5%, carencia de nutrientes…), o metabólicamente activo bien como forma libre natatoria (células planctónicas) o como forma sésil, normalmente asociada a superficies mucosales (especialmente las mucosas externas e internas de los peces) formando biofilms. Se trata de un patógeno multi-hospedador y zoonótico, capaz de causar una gran variedad de infecciones conocidas como vibriosis animal y humana. La vibriosis animal se manifiesta en forma de brotes o epizootias de elevada mortalidad en piscifactorías de anguila, su hospedador más susceptible. La bacteria infecta a través del agua y se asocia sobre todo a las mucosas del epitelio de las branquias desde donde accede a sangre, prolifera, se distribuye a los órganos internos y causa muerte por septicemia hemorrágica en menos de 24 h, siempre y cuando la temperatura ambiental esté por encima de 25ºC. La vibriosis humana cursa de dos formas principales relacionadas con la ruta de infección que puede ser oral o por contacto. En el primer caso el patógeno se ingiere con marisco o pescado crudo, coloniza el intestino y causa gastroenteritis que puede desde resolverse sin medicación a requerir hospitalización. En el segundo caso, la bacteria suele infectar heridas preexistentes por contacto con agua de mar o peces portadores o enfermos y causar graves infecciones manifestadas como fascitis necrotizante y celulitis que requieren hospitalización, desbridamiento e, incluso, la amputación del miembro infectado. En todos los casos, si el paciente es un paciente de riesgo, la vibriosis humana puede derivar en septicemia y muerte del paciente también en menos de 24 h. De hecho, la OMS y la FAO consideran que es el patógeno ligado a alimentos que causa la mayor mortandad en humanos a escala global. Estudios epidemiológicos demuestran que el principal factor de riesgo en humanos es una elevada concentración de hierro en sangre causada por distintas patologías subyacentes como hepatitis, cirrosis, cáncer de hígado, hemocromatosis etc. Resulta interesante que, en el caso de las anguilas, la bacteria pueda causar muerte por septicemia incluso en anguilas sanas. La especie incluye cepas avirulentas y virulentas para múltiples hospedadores por lo que es genéticamente muy variable. Además, es el único Vibrio relacionado con casos de zoonosis, en particular, con la transmisión de vibriosis animal a humanos por contacto de piscicultores con anguilas enfermas de piscifactoría. Clásicamente la especie se dividió en biotipos pero, este sistema de clasificación se está abandonando por resultar incompleto y se está sustituyendo por un sistema de clasificación filogenético. Recientemente, se ha propuesto que la especie se divida en 5 linajes filogenéticos y una patovariedad definida por la posesión de un plásmido de virulencia que confiere capacidad para infectar peces y que puede transmitirse por conjugación asociado a un plásmido conjugativo. Para esta patovariedad se propuso el nombre de piscis. De acuerdo con este sistema, las cepas zoonóticas constituyen un complejo clonal distribuido por todo el mundo que pertenece al linaje 2 y a la patovariedad piscis. También se ha demostrado que el plásmido de virulencia o una parte del mismo, se ha transmitido recientemente a otros linajes, distintos del linaje 2, y a otras especies de patógenos acuáticos como Aeromonas salmonicida, V. harveyi y Photobacterium damselae. De todos los factores de virulencia que produce V. vulnificus el único que está claramente relacionado con septicemia y muerte es una toxina denominada RtxA1. Esta toxina presenta un módulo externo conservado con secuencias repetidas ricas en glicina que flanquean un módulo interno variable divido en dominios funcionales distintos. Por el dominio externo la toxina se une a la membrana eucariótica y forma un poro permitiendo la translocación del módulo interno, uno de cuyos dominios tiene actividad endoproteolítica, se activa en presencia de inositol 6 fosfato celular y procesa el módulo interno separando los distintos dominios que son los responsables de la actividad citotóxica de la toxina. De momento se han descrito 8 tipos diferentes de toxinas RtxA1. La toxina que producen las cepas del complejo clonal está involucrada en septicemia como así lo han demostrado experimentos realizados con mutantes en anguilas y ratones. Además, se ha demostrado la relación de la toxina con una tormenta de citoquinas temprana en ratones, tormenta que podría explicar la rápida muerte de estos animales y de los humanos por sepsis. Por tanto, V. vulnificus es un patógeno septicémico multi-hospedador que se encuentra en expansión debido a que el calentamiento global favorece las condiciones ambientales óptimas para su proliferación en el ambiente. El estudio de este patógeno es de elevado interés en salud pública, ya que no sólo es responsable de la mayoría de muertes causadas por infecciones alimentarias a nivel mundial, sino que también es el causante de brotes de elevada mortalidad en piscifactorías que suponen importantes pérdidas económicas para el sector. Precisamente, las piscifactorías constituyen uno de los principales reservorios de este patógeno, favoreciendo su proliferación y eventos de transferencia genética horizontales esenciales en la evolución de la especie y la emergencia de nuevas variantes virulentas. El primer objetivo general de la presente tesis fue dilucidar los mecanismos de virulencia de este patógeno que le permiten causar septicemia en hospedadores tan distintos como humanos y peces. Puesto que la temperatura ambiental y la concentración de hierro son determinantes a la hora de producirse la septicemia en animales, en el primer caso, y en el hombre, en el segundo, nos hemos planteado como segundo objetivo general averiguar el papel que el hierro y la temperatura ambiental tienen como señales que activan la supervivencia de la bacteria dentro y fuera de su hospedador animal. Finalmente, el desenlace de una infección no depende solo de los mecanismos de virulencia específicos del patógeno sino también de la capacidad del hospedador de modular una respuesta inmunitaria adecuada y eliminarlo. Por tanto, para comprender de forma global la relación hospedador-patógeno se deben determinar no solo los mecanismos de virulencia utilizados por el patógeno sino también la estrategia de defensa desplegada por el hospedador durante la infección. En consecuencia, el tercer objetivo general fue determinar la respuesta inmunitaria del principal hospedador animal de V. vulnificus, la anguila, durante la infección usando distintos tipos de aproximaciones ex vivo e in vivo. Para conseguir estos objetivos generales, hemos utilizado una cepa representativa del complejo clonal zoonótico (cepa CECT4999 o R99) de genoma secuenciado y anotado y hemos usado modelos de septicemia in vitro, ex vivo e in vivo. Hemos analizado la transcriptómica global de patógeno y hospedador aplicando tecnologías de hibridación con microarrays específicamente diseñados para la cepa problema y para la anguila, en particular, para la detección de los genes de su sistema inmunitario, así como RNAseq y dual-RNAseq, modalidad que permite analizar a partir de la misma muestra, los genes de patógeno y hospedador que son transcritos. Los resultados transcriptómicos pusieron de manifiesto procesos y genes relevantes en la infección que fueron validados aplicando técnicas de mutagénesis dirigida hacia genes concretos del patógeno y usando la cepa parental y sus mutantes en ensayos fenotípicos específicamente diseñados para cada uno de los procesos detectados. En función de los distintos objetivos, hemos realizado los siguientes experimentos: 1) Para conocer la influencia de la concentración de hierro (ambiental o presente en la sangre del hospedador) en el ciclo de vida de esta bacteria, hemos crecido la cepa parental y un mutante deficiente en el regulador Fur en un medio mínimo en presencia y ausencia de hierro y analizado y comparado los transcriptomas. 2) Para conocer el papel de la temperatura ambiental (del agua o del hospedador) en las estrategias de supervivencia y virulencia de esta bacteria, hemos crecido la cepa parental a temperaturas a las cuales no es virulenta y temperaturas a las cuales es virulenta presentando distintos grados de virulencia y analizado y comparado los transcriptomas. 3) Para comprender los mecanismos que esta especie utiliza para causar septicemia en hospedadores evolutivamente tan distantes como el hombre y la anguila, hemos infectado suero y sangre artificial de anguila y humano, sano y con sobrecarga de hierro y analizado y comparado los transcriptomas. 4) Para conocer cómo responde el hospedador a la infección con V. vulnificus hemos realizado experimentos ex vivo (sangre artificial; dual RNAseq) e in vivo (anguilas infectadas por baño; hibridación con microarrays) y determinado el transcriptoma del hospedador en ambos casos. 5) Para averiguar si la toxina RtxA1 está involucrada en muerte por sepsis al desencadenar una tormenta de citoquinas temprana hemos realizado experimentos in vivo infectando células con la cepa parental y una mutante deficiente en la toxina y analizado y comparado el transcriptoma de los animales en distintos compartimentos celulares y a lo largo del tiempo. La unificación del conjunto de resultados obtenidos en este trabajo nos ha permitido construir una serie de modelos que intentar explicar el ciclo de vida de V. vulnificus dentro y fuera de sus principales hospedadores, así como dar respuesta a una serie de incógnitas respecto a la vibriosis en anguila y humanos. Los resultados más relevantes se encuentran resumidos a continuación. La concentración de hierro y la temperatura ambientales controlan la supervivencia de V. vulnificus dentro y fuera de sus hospedadores. Hemos determinado el regulon Fur (Ferric uptake regulator), el estimulón hierro y el estimulón temperatura, definidos como el conjunto de genes del patógeno cuya expresión cambia en función de la presencia o ausencia del regulador Fur, la concentración de hierro en el medio, y la temperatura ambiental, respectivamente. Nuestros resultados demuestran que el hierro es una de las principales señales a las que responde esta bacteria, principalmente a través del regulador global Fur, capaz de desencadenar una estrategia de supervivencia adaptada al ambiente (medio acuático o sangre del hospedador). Así, cuando el hierro es escaso en el ambiente V. vulnificus forma biofilms como estrategia de supervivencia, mientras que cuando el hierro es abundante en el agua (condiciones que se dan en piscifactorías) la bacteria se dispersa de los biofilms y cambia a un modo de vida libre, formando células capsuladas, móviles (gracias a la producción del flagelo) y altamente infectivas. Además, la temperatura también afecta a la supervivencia de V. vulnificus en el ambiente y a su virulencia, puesto que es incapaz de infectar a temperaturas inferiores a 20ºC mientras que es altamente infectivo a temperaturas por encima de los 25ºC, siendo 28ºC la temperatura a la que se producen brotes de elevada mortalidad en peces. Nuestros resultados contribuyen a explicar la dependencia entre la temperatura ambiental y la virulencia de este patógeno, ya que muestran que gran parte de las actividades bacterianas que permiten la colonización de los hospedadores (incluidos humanos) como son la movilidad, la quimiotaxis y la secreción de proteasas, así como la producción de una envuelta protectora frente a las defensas del hospedador, aumentan con un aumento en la temperatura y por tanto conllevan un aumento en la probabilidad de infección. V. vulnificus expresa un fenotipo virulento adaptado a hospedador y dependiente de hierro. Hemos demostrado que V. vulnificus no solo responde a los niveles de hierro exógenos sino que, además, los cambia, como consecuencia de su crecimiento en sangre durante la septicemia. Este cambio lo produce probablemente al lisar los glóbulos rojos y liberar hemoglobina. De hecho, 1 de cada 2 genes detectados como diferencialmente expresados en suero/sangre pertenecen al estimulón hierro y/ al regulón Fur). En sangre, el patógeno responde al ataque de señales secretadas por parte del hospedador (por ejemplo, formas reactivas del oxígeno [ROS] y el óxido nítrico por parte de las células del sistema inmunitario) transcribiendo genes para la inactivación de estas señales y para la reparación de la membrana. Además, en la sangre de sus hospedadores la bacteria sobreexpresa una serie de genes destinados a activar un metabolismo anaeróbico que en la anguila depende de la oxidación de compuestos del nitrógeno, mediante respiración de nitratos/nitritos, mientras que en humanos con niveles elevados de hierro en sangre (pacientes de riesgo) depende de la oxidación de compuestos derivados del glicógeno mediante respiración anaeróbica de fumarato. De acuerdo a los resultados transcriptómicos obtenidos en esta tesis y apoyados en estudios previos, proponemos que la señal que desencadena la activación del metabolismo anaeróbico en sangre se transmitiría a través de PspABC (sistema inducido por el estrés generado en la membrana bacteriana) en ambos hospedadores y, en el caso de los humanos, además, parece depender del nivel de catecolaminas detectado a través de QseBC. Fur también juega un papel central en determinar la fuente de nutrientes preferida por la bacteria bien como apo-Fur, a través de Lrp en anguila, bien como holo-Fur, a través de rutas de señalización desconocidas, en humanos. Una vez en la sangre de sus hospedadores, V. vulnificus expresa un fenotipo tóxico adaptado a hospedador, basado en la producción de las toxinas VvhA y RtxA1 y una envoltura protectora que le permiten resistir la acción del complemento del hospedador, multiplicarse de forma eficaz y producir septicemia. Los resultados transcriptómicos sugieren que la concentración de hierro y Fur (a través de otros reguladores transcripcionales globales como SmcR y HlyU) juegan un papel significativo en la activación de VvhA y RtxA1 y, por tanto, en la expresión del fenotipo tóxico. Para confirmar estos resultados transcriptómicos hemos realizado experimentos fenotípicos adicionales cuyos resultados sugieren que en el caso de los pacientes humanos de riesgo, ambas toxinas actúan de forma aditiva desde el principio de la infección, mientras que en anguila actúan de forma secuencial, produciéndose primero la hemolisina VvhA, que genera un cambio en la concentración de hierro en sangre al lisar eritrocitos e induce la activación de RtxA3 que actúa más tardíamente en la infección. La envoltura protectora óptima (en términos de producción de cápsula y antígeno O del lipopolisacárido) frente al sistema inmunitario producida por V. vulnificus en la sangre de sus hospedadores susceptibles es un proceso regulado no solo por hierro y Fur, sino también por la temperatura. Así, la bacteria produce una envoltura rica en cápsula sólo en la sangre de humanos con niveles elevados de hierro en sangre que la hace resistente al complemento y la fagocitosis. Este resultado demuestra que la cápsula es absolutamente esencial para resistir y sobrevivir en sangre humana y explica por qué no hay casos de septicemia entre pacientes sanos ya que al no producir cápsula, la bacteria muere en la sangre de estos pacientes. En la sangre de anguila, restrictiva en hierro ya que éste se encuentra unido a transferrina, V. vulnificus produce una envoltura rica en antígeno O, pero sólo a temperaturas por encima de 25ºC y de manera óptima a 28ºC (temperatura del agua durante brotes de vibriosis que causan alta mortalidad en piscifactorías). Además, en sangre de anguila la bacteria produce dos proteínas de membrana externa reguladas por hierro y temperatura (una de ellas), una que actúa como receptor específico para la transferrina de peces (Ftbp) y otra que protege a la bacteria del complemento y la fagocitosis (Fpcrp). Ambas proteínas constituyen un “kit de supervivencia en sangre” que está codificado en el plásmido de virulencia y que permite a la bacteria multiplicarse de forma eficaz en la sangre de peces sanos. El kit ha sido transferido entre linajes dentro de la especie y a otros patógenos de peces lo que confirma el papel de la transferencia genética horizontal en la emergencia de nuevos patógenos en el entorno de las piscifactorías. El T6SS (sistema de secreción de tipo IV), a través de la toxina VgrG, de V. vulnificus puede estar implicado en la supervivencia y defensa de la bacteria frente a la fagocitosis y al ataque por las células de la anguila. Nuestros resultados transcriptómicos revelan una sobreexpresión de vgrG en presencia de células rojas (CR) de la sangre de anguila, sólo cuando estas son lisadas. Por tanto, la producción de esta toxina podría estar regulada por hierro y estar implicada en la defensa frente al ataque de células eucariotas. Experimentos fenotípicos adicionales sugieren que la toxina VgrG, proteína efectora del T6SS, sí está regulada por hierro y participa en la supervivencia de V. vulnificus en su medio natural otorgándole resistencia frente a sus predadores naturales (amebas) y en el interior de sus hospedadores al estar implicado en citotoxicidad a CR de la sangre de anguila. Estos resultados deben considerarse preliminares, y requieren estudios en profundidad para dilucidar el mecanismo molecular que activa la producción y la acción de esta toxina. En la respuesta inmunitaria de la anguila frente a V. vulnificus participan tanto CR como células blancas (CB) sanguíneas. Combinando experimentos ex vivo en sangre artificial de anguila, con infecciones de animales in vivo, hemos obtenido resultados interesantes sobre la respuesta inmunitaria de la anguila durante la interacción hospedador-patógeno. Así, por primera vez, hemos descrito que las CR nucleadas, como es el caso de las de los peces teleósteos (entre ellos, la anguila) participan en la respuesta inmunitaria frente a patógenos bacterianos septicémicos como V. vulnificus. Los resultados obtenidos ex vivo aportan múltiples evidencias transcriptómicas de la acción de la toxina RtxA1 sobre las células de la sangre (tanto CR como CB) en forma de genes regulados hacia arriba para reparación del citoesqueleto celular (respuesta a la acción del dominio entrecruzador de actina [ACD] de la toxina), activación del tráfico endosomal (achacable al dominio alfa-beta hidrolasa [ABH] de la toxina) y activación de la muerte celular por apoptosis (por la acción del dominio MCF de la toxina). Además, nuestros resultados muestran que las CR, que son las células más abundantes en la sangre de anguila (109 CR/ml, aprox. 1000 CR por cada CB), son transcripcionalmente activas y actúan como células inmunitarias: tras la infección con el patógeno, regularon hacia arriba múltiples genes relacionados con reconocimiento, procesamiento y presentación de antígenos, producción de TNFa y diálogo cruzado con otras células inmunitarias, principalmente linfocitos T y, probablemente, plaquetas y células endoteliales. Nuestros resultados también revelan que las CR pueden actuar como células efectoras, ya que activan la transcripción de genes para galectina3, prostaglandinas, reciclaje de transferrina y coagulación de la sangre (incluida la fibronectina). Entre los diferentes genes relacionados con la conversación cruzada con otras células inmunitarias, destacamos un gen que codifica un tipo específico de TNFa que responde al LPS (litnfa). La concentración de CR en la sangre de la anguila es tan alta que, probablemente, pequeñas cantidades de LITNFa podrían conllevar cambios importantes en la producción de citocinas y quimiocinas. De hecho, entre los transcritos más sobreexpresados hemos observado numerosos genes relacionados con la respuesta a TNFa. Las CB por su parte actúan contra las bacterias activando la transcripción de genes para la producción de ROS y, probablemente, péptidos microcidas, así como de genes que les permiten actuar como células presentadoras de antígeno profesionales (activación de la transcripción de múltiples genes para TLRs, citoquinas y sus receptores, receptores de inmunoglobulinas, etc.), transductores de señal y múltiples retrotransposones. Un resultado especialmente interesante, es la activación de la transcripción del gen que codifica Il17c, una citocina que actúa de manera coordinada con Il6 activando la producción de las mucinas secretadas (Muc5B, la transcripción de cuyo gen también se encuentra activada en CB según nuestros resultados) por las células epiteliales y mucosales. El papel de estas mucinas es atrapar bacterias colaborando en su eliminación de los tejidos de la mucosa, lo que sugiere una conexión entre la inmunidad sistémica con la mucosal. En conjunto, este resultado sugiere que los leucocitos estimulados por el patógeno podrían migrar a los tejidos de la mucosa y secretar directamente mucinas contra el patógeno, hipótesis que quedaría por demostrar. Los resultados obtenidos a partir de experimentos in vivo son, si cabe, más interesantes ya que, además de confirmar parte de los resultados obtenido ex vivo, sugieren que la anguila responde a la infección por V. vulnificus generando una fuerte y rápida respuesta de tipo inflamatoria activada sobre todo por las CR, que parecen ser la principal diana de la toxina RtxA1 in vivo. Este hecho constituye un resultado sumamente novedoso y está apoyado por la regulación hacia arriba de miles de genes por parte de las CR en contraposición con cientos de genes por parte de las CB. Además, tanto CR como CB activan una respuesta atípica, en parte debida a la activación de mecanismos de defensa anti-vírica, en respuesta al patógeno que incluyen un RNA de interferencia (RNAi) y que es el gen que se detecta en sangre como el más fuertemente activado a las 12 h de infección. Esta respuesta anti-vírica resulta sorprendente dado que V. vulnificus es un patógeno extracelular sin existencia intracelular como la que se requeriría para activar este tipo de respuesta. La toxina RtxA1 está implicada en la generación de un choque séptico que causa la muerte de las anguilas infectadas por V. vulnificus. Comparando los datos transcriptómicos obtenidos en sangre de anguilas infectadas (tanto ex vivo como in vivo) con la cepa parental del complejo clonal zoónotico de V. vulnificus y con los de las infectadas con su mutante deficiente en la toxina RtxA1, hemos podido relacionar la producción de la toxina con una respuesta temprana de tipo inflamatorio que es sobre todo evidente en los ensayos realizados in vivo, lo que relaciona la toxina con muerte por choque tóxico debida a una tormenta temprana de citoquinas, proceso que de manera similar ha sido previamente descrito en ratón. Es más, los resultados obtenidos a partir de los datos de los experimentos ex vivo relacionan la toxina RtxA1 además con una tormenta de retrotransposones a nivel celular, fenómeno que se ha descrito muy recientemente asociado a enfermedades humanas no infecciosas y merece un estudio en profundidad. Además, hemos encontrado evidencias de que la respuesta inflamatoria podría relacionarse con un daño masivo seguido de una respuesta transcriptómica muy elevada por parte de las CR, siendo éstas las células de la sangre transcripcionalmente más activas in vivo. Finalmente, hemos encontrado evidencias que permiten asociar la toxina con la activación de una respuesta anti-viral in vivo, probablemente mediadas por la liberación de RNAi y por el silenciamiento de microRNAs (miRNA-142a) involucrados en la regulación de respuesta inmunitaria protectora, y por tanto en la muerte de la anguila mediada por la toxina. En resumen, V. vulnificus es un patógeno versátil que ha desarrollado múltiples estrategias para sobrevivir en ambientes tan dispares como el agua, las mucosas, la sangre humana, la sangre de anguila, etc. Esta capacidad de adaptación al ambiente, le permite expresar un fenotipo virulento adaptado al hospedador que es dependiente de hierro y que es acentuado por la temperatura, causando muerte por septicemia en hospedadores tan distintos como humanos y peces. El fenotipo virulento está basado en la actividad de las toxinas VvhA y RtxA1 y en la producción de una envoltura protectora generalista pero dependiente de hospedador. En el caso de pacientes humanos de riesgo, esta envoltura está enriquecida en cápsula, mientras que en anguilas está enriquecida en antígeno O y contiene dos proteínas de membrana externa codificadas en el plásmido de virulencia (Fpcrp y Ftbp) que constituyen un “kit de supervivencia en sangre” que confiere capacidad para resistir específicamente la inmunidad innata de los peces, explicando en parte por qué el patógeno es tan virulento en anguilas sanas. Por otro lado, mediante el estudio de la interacción hospedador-patógeno entre esta bacteria y su principal hospedador, la anguila, hemos puesto de manifiesto que tanto las CB como las CR de la sangre de peces teleósteos responden a la infección causada por patógenos bacterianos septicémicos, y que la toxina RtxA1 de V. vulnificus está implicada en la generación de una respuesta atípica e intracelular en fases muy tempranas de la infección. Esta respuesta está ligada a una tormenta de citoquinas y/o retrotransposones directamente relacionada con la muerte de los animales. El conjunto del trabajo realizado en esta tesis aporta gran cantidad de datos transcriptómicos obtenidos del estudio de la relación hospedador-patógeno entre V. vulnificus y su hospedador principal, la anguila, abriendo la puerta a nuevas hipótesis para futuras proyectos como el estudio de nuevos factores de virulencia del patógeno (i.e., activación de metabolismo anaeróbico en sangre del hospedador, T6SS) o el desarrollo de nuevas herramientas de inmunoterapia (i.e., miR-142a) para prevenir brotes de V. vulnificus en piscifactorías, que constituyen el mayor reservorio para este patógeno y suponen un riesgo para la acuicultura y la salud pública. Vibrio vulnificus is a worldwide distributed pathogen traditionally isolated from temperate aquatic ecosystems, whose geographical distribution is currently spreading due to global warming. The species is genetically variable and only the strains that belong to the zoonotic clonal-complex (serovar E within pathovar piscis [formerly biotype 2]) are able to cause disease, with multiple clinical manifestations collectively known as vibriosis, in humans and fishes. The most severe form of vibriosis is hemorrhagic septicemia that, in case of eels it affects healthy animals, while in case of humans mainly affects susceptible patients (those with high levels of free iron in blood [iron-overloaded humans] due to different underlying pathologies). In both cases, septicemia is a very rapid disease that leads to death by sepsis in less than 48 h. The main aim of this thesis is to gain insights into the pathogen’s virulence mechanisms that allow it to cause septicemia in hosts as evolutionary distant as human and fish. To this end, we have selected a representative strain of the zoonotic clonal-complex and applied a combination of transcriptomic and single gene approaches using in vitro and ex vivo models of septicemia to understand how iron and temperature (either outside [water] or inside its host) influence V. vulnificus virulence. First, we have analyzed how Fur (Ferric uptake regulator) mediated the global bacterial response to iron (both iron excess and iron starvation conditions). As a result, we have described the iron stimulon and Fur regulon of V. vulnificus and demonstrated that iron, not always throw Fur, controls the entire life cycle of this pathogen, from its survival in the marine environment (including motility and chemotaxis) to its survival in the blood of their hosts (including host-specific mechanisms of resistance to innate immunity). Second, we have described a host-adapted virulent phenotype that V. vulnificus expresses in the blood of its main susceptible hosts (iron-overloaded humans and healthy eels) by changing metabolism preferences from aerobic to anaerobic (based on amino or glycogen compounds utilization in eels or human blood, respectively) and combining a hostspecific protective envelope (capsule enriched for humans and O-antigen enriched for eels) with the common expression of two toxins (VvhA and RtxA1). Moreover, the zoonotic strains have bypassed the iron requirement of the species for fish infection due to the acquisition of two iron-regulated outer membrane proteins (Ftbp and Fpcrp) involved in resistance to fish innate immunity: Ftbp conferring ability to specifically bind to fish transferrin in order to acquire iron from it; and Fpcrp conferring resistance to fish complement and phagocytosis. Finally, temperature contributes to the host-adapted virulent phenotype, since an increase in temperature (from environmental [around 20ºC] to infective [28ºC for fish and 37ºC for humans] temperatures) entails bacterium fitness which leads to an optimal physiological state that adapts the pathogen for the subsequent host invasion and survival in blood. This, in combination with exogenous iron sources, increases the expression of virulence factors in a host-specific manner. Given that the outcome of an infection depends not only on the virulent mechanisms expressed by the pathogen but also on the host ability to modulate a suitable immune response to eliminate the pathogen, we have also performed ex vivo and in vivo experiments in order to gain insights into the eel immune response against V. vulnificus as well as to understand the host-pathogen relationship. Analyzing the immune transcriptome expressed in eel blood during vibriosis we have proved that eel RBC (red blood cells), as nucleated cells, are transcriptionally active and involved in the immune response against bacterial pathogens not only as antigen recognition, processing and presentation cells but also with ability to produce effectors (i.e., TNF, cytokines, lectins and prostaglandins). Finally, we have also analyzed the immune transcriptome in eel blood during vibriosis caused by a V. vulnificus mutant strain lacking RtxA1 (a strain that cause septicemia but do not kill the animals) and found strong evidence for an early intracellular and atypical immune response induced by RtxA1. This atypical response is mainly carried out by RBC and is based on a rapid cytokine/retrotransposon storm, mediated by a systemic RNAi and an anti-silencing protein, which by unknown mechanisms could lead to the inactivation of miRNA-142a resulting in an exacerbated immune response which eventually causes eel death. In conclusion, V. vulnificus has the ability to express an iron-dependent and host-adapted virulent phenotype based on of a generalist but host-dependent protective envelope plus the common overexpression of RtxA1 and VvhA. In the case of humans, the envelope is enriched in the capsule, while in eels it contains Fpcrp and Ftbp that together confrom a “survival in fish blood kit” which confers specific ability to resist fish innate immunity. Moreover, host-pathogen interaction studies in V. vulnificus and its main host, the eel, have opened the door for new hypothesis and future projects, such as the study of new putative bacterial virulence factors (i.e., T6SS) and the development of new immunotherapeutic tools (i.e., miR-142a) to prevent V. vulnificus outbreaks in fish farms, the major reservoir of this pathogen.