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RESEARCH PRODUCT

Die Ultrazentrifuge als Kriterium für molekulare Einheitlichkeit. Grenze des Auflösungsvermögens und der Empfindlichkeit

subject

description

Die Gradientenkurve einer zusammengesetzten, in der Ultrazentrifuge sedimentierenden Grenzschicht von zwei Komponenten wird auf Grund einfacher Voraussetzungen berechnet, welche praktisch z. B. bei einer Mischung der α-Amylasen aus Bacillus subtilis und Humanspeichel zutreffen. Dabei wird ein Ausdruck fur das Auflosevermogen der Sedimentation in Einheiten molekularer und apparativ vorgegebener Konstanten abgeleitet: Diskontinuitat der Verteilung der Sedimentationskoeffizienten vorausgesetzt, ist danach fur die Ausbildung getrennter Maxima in der Gradientenkurve ein Mindestunterschied der Sedimentationskoeffizienten erforderlich, welcher sich nach dieser Formel mit dem Wert A > 1 abschatzen last. Die rechnerische Behandlung des Modells zeigt ferner, das bei Mengengleichheit der beiden Komponenten von A > 0,5 an bereits durch eine Analyse der Kurvenform sichtbar gemacht werden kann, das die Modellsubstanz nicht einheitlich ist. Die Anwendung dieser Methode setzt allerdings konzentrationsunabhangige Sedimentation und Diffusion voraus. Das empfindlichste Kriterium fur eine einheitliche Sedimentation beruht auf dem Vergleich des scheinbaren Diffusionskoeffizienten, der aus der sedimentierenden Grenzschicht ermittelt wird, mit dem wirklichen Diffusionskoeffizienten, der auf unabhangigem Wege zusatzlich bestimmt werden mus. Dieses Kriterium kann auch dort herangezogen werden, wo lineare Konzentrationsabhangigkeit des Sedimentationskoeffizienten vorliegt, wenn der storende Einflus der Selbstscharfung der Grenzschicht nach FUJITA berucksichtigt wird. Bei gewohnlicher experimenteller Genauigkeit beginnt die Empfindlichkeit des letzten Verfahrens gegenuber uneinheitlicher Sedimentation, wenn der Abstand der beiden Sedimentationskoeffizienten einen Wert uberschreitet, der durch A > 0,25 abgegrenzt werden kann. The gradient curve of a sedimenting boundary formed by two components has been evaluated using simple assumptions which are actually realized e.g. in a mixture of the α-amylases from Bacillus subtilis and human saliva. The following expression for the resolution power of sedimentation has been derived, which contains some constants predicted from molecular properties, and from the apparatus, Assuming discontinuity in the distribution of sedimentation coefficients, in common ultra-centrifuges separated peaks appear in the boundary if (s2−s1)/s exceeds a minimum value, given by this formula with A > 1. Furthermore, calculations using this model have shown that in the case of equal amounts of the two components, nonhomogeneity of the mixture can already be recognized from the shape of the curve, if A > 0.5. The exactness of this method supposes sedimentation and diffusion coefficients to be independent of concentration. The most sensitive criterion for uniform sedimentation is to compare the apparent diffusion coefficient (evaluated from sedimenting boundary) with the real diffusion coefficient (obtained from independent experiments). This criterion remains valid, also if a linear relationship exists between sedimentation coefficient and concentration. In this case it is necessary, according to FUJITA, to account for self-sharpening of the boundary. In recognizing non-uniform sedimentation, this procedure is successful if A > 0.25, assuming usual experimental errors.