Keyhole Limpet Hemocyanin: Molecular Structure of a Potent Marine Immunoactivator

Objectives: In this short review we present a survey of the available biochemical and electron microscopic data on keyhole limpet hemocyanin (KLH). Results: The b

Mg2+ binding triggers rearrangement of the IM30 ring structure, resulting in augmented exposure of hydrophobic surfaces competent for membrane binding

The "inner membrane-associated protein of 30 kDa" (IM30), also known as "vesicle-inducing protein in plastids 1" (Vipp1), is found in the majority of photosynthetic organisms that use oxygen as an energy source, and its occurrence appears to be coupled to the existence of thylakoid membranes in cyanobacteria and chloroplasts. IM30 is most likely involved in thylakoid membrane biogenesis and/or maintenance, and has recently been shown to function as a membrane fusion protein in presence of Mg2+ However, the precise role of Mg2+ in this process and its impact on the structure and function of IM30 remains unknown. Here, we show that Mg2+ binds directly to IM30 with a binding affinity of ∼1 mm …

Nervenzellen, Gliazellen und Nervensysteme

Faszination Forschung: Das Gehirn im Gleichgewicht halten Ihr Gehirn versetzt Sie in die Lage, den Stoff dieses Kapitels zu lernen – die Worter zu lesen, die Illustrationen zu verstehen und Informationen zu speichern, die es Ihnen erlauben, die anschliesenden Fragen zu beantworten. Es erfordert Anstrengung, den Stoff dieses Kapitels zu bewaltigen, aber wenn Sie diese Muhe aufbringen, werden Sie erfahren, wie das Gehirn Informationen empfangt und verarbeitet. Stellen Sie sich vor, wie es ware, wenn Sie wenig von diesem Stoff lernen konnten – ganz gleich, wie sehr Sie sich in dieses Buch vertieften. In dieser Lage befinden sich Menschen mit dem Down-Syndrom, einer Erkrankung, die eines von 70…

IM30 triggers membrane fusion in cyanobacteria and chloroplasts

The thylakoid membrane of chloroplasts and cyanobacteria is a unique internal membrane system harbouring the complexes of the photosynthetic electron transfer chain. Despite their apparent importance, little is known about the biogenesis and maintenance of thylakoid membranes. Although membrane fusion events are essential for the formation of thylakoid membranes, proteins involved in membrane fusion have yet to be identified in photosynthetic cells or organelles. Here we show that IM30, a conserved chloroplast and cyanobacterial protein of approximately 30 kDa binds as an oligomeric ring in a well-defined geometry specifically to membranes containing anionic lipids. Triggered by Mg2+, membr…

The IM30/Vipp1 C-terminus associates with the lipid bilayer and modulates membrane fusion.

IM30/Vipp1 proteins are crucial for thylakoid membrane biogenesis in chloroplasts and cyanobacteria. A characteristic C-terminal extension distinguishes these proteins from the homologous bacterial PspA proteins, and this extension has been discussed to be key for the IM30/Vipp1 activity. Here we report that the extension of the Synechocystis IM30 protein is indispensable, and argue that both, the N-terminal PspA-domain as well as the C-terminal extension are needed in order for the IM30 protein to conduct its in vivo function. In vitro, we show that the PspA-domain of IM30 is vital for stability/folding and oligomer formation of IM30 as well as for IM30-triggered membrane fusion. In contra…

Ernährung, Verdauung und Resorption

Faszination Forschung: Effiziente Verwertung der Nahrung Jahrtausende lang waren die Pima im Sudwesten von Nordamerika Jager und Sammler, die ihre Ernahrung durch Ackerbau erganzten. Das Klima, in dem sie lebten, war arid, daher entwickelten sie raffinierte Bewasserungssysteme; dennoch erlebten sie immer wieder Durreperioden und darauf folgend Hungersnote. Heute sind die meisten Menschen, die ethnisch zur Pimapopulation in den Vereinigten Staaten gehoren, im klinischen Sinne fettleibig (adipos). Das Durchschnittsgewicht ihrer Population ist tatsachlich eines der hochsten der Welt. Die Pima leiden unter gesundheitlichen Problemen, die mit starkem Ubergewicht einhergehen konnen, wie Diabetes,…

Vererbung, Gene und Chromosomen

Faszination Forschung: Wie lauten die Regeln der Vererbung? Rot ist mit nur etwa 1 % beim Menschen die seltenste naturliche Haarfarbe. Sie ist im Norden Europas am haufigsten, wobei Schottland mit etwa 15 % rothaariger Bevolkerung den ersten Platz belegt. Im Lauf der Geschichte hat man immer wieder versucht, zwischen der roten Haarfarbe und anderen Eigenschaften einen Zusammenhang herzustellen. So werden beispielsweise rote Haare haufig mit einem leidenschaftlichen Temperament assoziiert. Eine vor Kurzem durchgefuhrte Studie eines Hamburger Forschungsinstituts uber die sexuelle Aktivitat Hunderter von Frauen hat ergeben, dass Rothaarige haufiger Sex haben als alle anderen Frauen. Es wurde s…

Fortpflanzung der Tiere

Faszination Forschung: Keine Zeit zu verlieren Weibliche Derbywallabys (auch Tammar-Wallabys genannt) werden kurz nach der Geburt eines Jungtiers wieder empfangnisbereit und paaren sich. Der resultierende Embryo kann jederzeit zwischen einem Monat und einem Jahr spater geboren werden. Menschen haben eine neunmonatige Schwangerschaft, daher erscheint uns diese hochst variable Trachtigkeitsdauer ungewohnlich und fuhrt zu Fragen nach dem „Warum“ und dem „Wie“. Um das zu beantworten, muss man Folgendes wissen: Ein Wallaby ist bei seiner Geburt noch sehr unreif. Es kriecht in den Beutel (das Marsupium) seiner Mutter; dort saugt es sich an einer Zitze fest und wachst zehn Monate lang heran, bis e…

Nucleinsäuren und die Entstehung des Lebens

Faszination Forschung: Die Suche nach Leben Auf der Erde existieren Lebewesen, oder zumindest ihre chemischen Spuren, an allen erdenklichen Orten – selbst in den tiefsten Zonen der Meere, in Gesteinen, im Inneren von Vulkanen, im Polareis und in hoheren Luftschichten. Den Ursprung des Lebens zu finden ist allerdings keine leichte Aufgabe, da einfach gebaute und bereits fruh in der Erdgeschichte existierende Organismen (bis auf wenige Ausnahmen) keine Fossilien hinterliesen. Auf dem Mars, so hoffen Wissenschaftler, konnte das anders sein. Seit Jahrtausenden fasziniert der Rote Planet die Menschen, seit Erfindung des Teleskops insbesondere Wissenschaftler und Science-Fiction-Autoren. Der Mars…

Structure of a molluscan hemocyanin didecamer (HtH1 from Haliotis tuberculata) at 12 Å resolution by cryoelectron microscopy

A 12 A resolution three-dimensional density map of the Haliotis tuberculata hemocyanin type 1 (HtH1) didecamer has been obtained by cryoelectron microscopy of unstained molecules and angular reconstitution. The dyad symmetry of the 8 MDa D5 HtH1 didecamer, formed by the pairing of two asymmetric 4 MDa ring-like C5 decamers, is emphasised. The major and minor surface helical grooves of the didecamer are well defined, in agreement with earlier data on molluscan hemocyanins. The location of the obliquely orientated repeating unit, a subunit dimer, within the decamer has been defined. Following interactive extraction of this dimer, several new structural features of the dimer and of the subunit…

Structures of two molluscan hemocyanin genes: significance for gene evolution.

We present here the description of genes coding for molluscan hemocyanins. Two distantly related mollusks, Haliotis tuberculata and Octopus dofleini , were studied. The typical architecture of a molluscan hemocyanin subunit, which is a string of seven or eight globular functional units (FUs, designated a to h, about 50 kDa each), is reflected by the gene organization: a series of eight structurally related coding regions in Haliotis , corresponding to FU-a to FU-h, with seven highly variable linker introns of 174 to 3,198 bp length (all in phase 1). In Octopus seven coding regions (FU-a to FU-g) are found, separated by phase 1 introns varying in length from 100 bp to 910 bp. Both genes exh…

Nautilus pompilius Hemocyanin: 9 Å Cryo-EM Structure and Molecular Model Reveal the Subunit Pathway and the Interfaces between the 70 Functional Units

Hemocyanins are giant extracellular oxygen carriers in the hemolymph of many molluscs. Nautilus pompilius (Cephalopoda) hemocyanin is a cylindrical decamer of a 350 kDa polypeptide subunit that in turn is a "pearl-chain" of seven different functional units (FU-a to FU-g). Each globular FU has a binuclear copper centre that reversibly binds one O(2) molecule, and the 70-FU decamer is a highly allosteric protein. Its primary structure and an 11 A cryo-electron microscopy (cryo-EM) structure have recently been determined, and the crystal structures of two related FU types are available in the databanks. However, in molluscan hemocyanin, the precise subunit pathway within the decamer, the inter…

3D reconstruction of the hemocyanin subunit dimer from the chiton Acanthochiton fascicularis.

Procedures are presented for the purification of the subunit dimer from Acanthochiton fasicularis hemocyanin. Electron microscopy of negatively stained specimens revealed a uniform population of macromolecules possessing the characteristic "boat shape". A 3D reconstruction from this EM data generated a approximately 3 nm resolution model that correlates well with earlier data of the purported subunit dimer, extracted from the 3D reconstruction of the didecamer of Haliotis tuberculata hemocyanin type 1.

Keyhole limpet haemocyanin: negative staining in the presence of trehalose

Abstract Samples of unpurified and purified haemocyanin from the giant keyhole limpet Megathura crenulata have been studied by transmission electron microscopy (TEM) using mixtures of trehalose with the negative stains, uranyl acetate and ammonium molybdate. Trehalose is a known protein preservative during air and freeze drying, UV irradiation and high temperatures, and therefore offers the possibility of protecting proteins during the drying of negatively-stained specimens and their subsequent electron microscopical study. Evidence is presented that trehalose possesses satisfactory stability within the electron beam during conventional room temperature, negative-staining studies. The combi…

Limulus polyphemus Hemocyanin: 10 Å Cryo-EM Structure, Sequence Analysis, Molecular Modelling and Rigid-body Fitting Reveal the Interfaces Between the Eight Hexamers

Abstract The blue copper protein hemocyanin from the horseshoe crab Limulus polyphemus is among the largest respiratory proteins found in nature (3.5 MDa) and exhibits a highly cooperative oxygen binding. Its 48 subunits are arranged as eight hexamers (1×6mers) that form the native 8×6mer in a nested hierarchy of 2×6mers and 4×6mers. This quaternary structure is established by eight subunit types (termed I, IIA, II, IIIA, IIIB, IV, V, and VI), of which only type II has been sequenced. Crystal structures of the 1×6mer are available, but for the 8×6mer only a 40 A 3D reconstruction exists. Consequently, the structural parameters of the 8×6mer are not firmly established, and the molecular inte…

DNA und ihre Funktion bei der Vererbung

Faszination Forschung: Die Replikation der DNA als Ziel fur eine Krebstherapie Hodenkrebs geht mit schnellen Teilungen der Keimzellen einher und breitet sich haufig auch uber Metastasen auf andere Organe aus. Dies ist die haufigste Krebsform bei jungen Mannern und einer der wenigen Tumoren bei Erwachsenen, der mithilfe des Wirkstoffs Cisplatin mit guten Erfolgschancen heilbar ist. Der Wissenschaftler Barnett Rosenberg wollte herausfinden, wie sich elektrische Felder auf Zellen auswirken. Er gab Bakterien in ein Kulturmedium mit Platinelektroden, die mit einer Batterie verbunden waren. Das Ergebnis war uberraschend: Die Bakterien horten auf, sich zu teilen. Um zu zeigen, dass diese Wirkung v…

The Sequence of a Gastropod Hemocyanin (HtH1 from Haliotis tuberculata)

The eight functional units (FUs), a-h, of the hemocyanin isoform HtH1 from Haliotis tuberculata (Prosobranchia, Archaeogastropoda) have been sequenced via cDNA, which provides the first complete primary structure of a gastropod hemocyanin subunit. With 3404 amino acids (392 kDa) it is the largest polypeptide sequence ever obtained for a respiratory protein. The cDNA comprises 10,758 base pairs and includes the coding regions for a short signal peptide, the eight different functional units, a 3'-untranslated region of 478 base pairs, and a poly(A) tail. The predicted protein contains 13 potential sites for N-linked carbohydrates (one for HtH1-a, none for HtH1-c, and two each for the other si…

Electron microscopy and biochemical characterization of a 350-kDa annular hemolymph protein from the keyhole limpet Megathura crenulata

The isolation and biochemical characterization of an annular non-hemocyanin hemolymph protein from a marine gastropod, the Californian giant keyhole limpet (Megathura crenulata) is presented. By analytical ultracentrifugation, the protein has a sedimentation coefficient of 12S and molecular mass of approximately 350 kDa. The subunit mass, obtained by SDS/PAGE in the presence of -SH reagent and 8 M urea, is approximately 35 kDa, thereby indicating the presence of 10 subunits in the native molecule. By negative staining, the protein is revealed in one predominant image projection as a pentagonal approximately 8 nm ring-like structure with an approximately 2-nm stain-filled centre and, in anot…

Minireview: Recent progress in hemocyanin research

This review summarizes recent highlights of our joint work on the structure, evolution, and function of a family of highly complex proteins, the hemocyanins. They are blue-pigmented oxygen carriers, occurring freely dissolved in the hemolymph of many arthropods and molluscs. They are copper type-3 proteins and bind one dioxygen molecule between two copper atoms in a side-on coordination. They possess between 6 and 160 oxygen-binding sites, and some of them display the highest molecular cooperativity observed in nature. The functional properties of hemocyanins can be convincingly described by either the Monod-Wyman-Changeux (MWC) model or its hierarchical extension, the Nested MWC model; the…

Comparison of testing acute toxicity on embryo of zebrafish, Brachydanio rerio and RTG-2 cytotoxicity as possible alternatives to the acute fish test

Abstract The present study compares two possible alternative methods to replace the acute fish test. Fertilized eggs of zebrafish, Brachydanio rerio were used to investigate the acute toxicity of chemicals. Different toxicological endpoints such as coagulation of the eggs, development of gastrulation, number of somites, development of organs, circulation, heartbeat, otolithanlage and pigmentation have been examined during the embryonic development of zebrafish within the first 48 h. Differences to the normal development were measured by these endpoints. Chemicals have been examined in a preliminary approach with respect to their cytotoxicity on the RTG-2 cells (Rainbow Trout Gonad). The vit…

Prozesse der Evolution

Faszination Forschung: Ein evolutionares Wettrusten zwischen Fledermausen und Nachtfaltern Viele Arten von Fledermausen ziehen sich tagsuber irgendwohin zum Schlafen zuruck und fliegen erst bei Anbruch der Dunkelheit los. Der massenhafte Abflug von Tausenden oder gar Millionen Fledermausen von einem solchen Schlafplatz ist ein beeindruckender Anblick und lockt oft zahlreiche Menschen an. In Stadten konnen die Hohlraume unter Brucken ein Treffpunkt fur gewaltige Fledermauskolonien sein. Einst jagten diese urbanen Fledermauskolonien den Menschen Angst ein. Inzwischen ist aber weithin bekannt, dass zahlreiche Fledermausarten nachtaktive Insekten erbeuten, darunter Stechmucken und Landwirtschaf…

Wechselbeziehungen zwischen Arten

Faszination Forschung: Der brandgefahrliche Rotfeuerfisch Den Auswirkungen menschlicher Aktivitaten haben die Korallenriffe im Bereich der Bahamas jahrhundertelang standgehalten. In den letzten beiden Jahrzehnten kam aber eine bislang unvergleichliche Bedrohung hinzu: das Vordringen zweier prachtiger, aber sehr invasiver Fischarten – der Pazifische Rotfeuerfisch (Pterois volitans) und der Indische Rotfeuerfisch (P. miles). Rotfeuerfische stammen aus dem Indopazifik; Mitte der 1980er-Jahre tauchten diese beliebten Aquarienfische erstmals vor der Kuste Floridas auf. Wie sie in ihren neuen Lebensraum gelangten, ist unklar. Nach DNA-Proben zu schliesen, wurden sie von arglosen Aquarianern im At…

Evolution of molluscan hemocyanin structures

AbstractHemocyanin transports oxygen in the hemolymph of many molluscs and arthropods and is therefore a central physiological factor in these animals. Molluscan hemocyanin molecules are oligomers composed of many protein subunits that in turn encompass subsets of distinct functional units. The structure and evolution of molluscan hemocyanin have been studied for decades, but it required the recent progress in DNA sequencing, X-ray crystallography and 3D electron microscopy to produce a detailed view of their structure and evolution. The basic quaternary structure is a cylindrical decamer 35nm in diameter, consisting of wall and collar (typically at one end of the cylinder). Depending on th…

Click modification of multifunctional liposomes bearing hyperbranched polyether chains.

Aiming at controlled modification of liposomal surface structures, we describe a postpreparational approach for surface derivatization of a new type of multifunctional, sterically stabilized liposomes. Application of dual centrifugation (DC) resulted in high encapsulation efficiencies above 50% at very small batch sizes with a total volume of 150 μL, which were conductive to fast and efficient optimization of variegated surface modification reactions. Cholesterol-polymer amphiphiles, including complex hyperbranched polyether structures bearing 1-4 terminal alkynes, were used in DC formulations to provide steric stabilization. The alkyne moieties were explored as anchors for the conjugation …

Die Erforschung des Lebens

Faszination Forschung: Korallen bei erhohten Wassertemperaturen Korallenriffe beherbergen in den Meeren die groste biologische Vielfalt. Sie beeindrucken durch ihre naturliche Schonheit und dienen fur rund 1 Mrd. Menschen als Fischgrunde und Kustenschutz. Im Laufe der letzten 20 Jahre ist weltweit etwa die Halfte aller riffbildenden Korallen durch den Anstieg der Wassertemperatur und andere Faktoren abgestorben. Die erhohten Temperaturen wirken sich verheerend auf einen faszinierenden Aspekt der Biologie von Korallen aus. Korallen sind Tiere. Die meisten von ihnen beherbergen in ihren Zellen aber sogenannte Zooxanthellen. Das sind einzellige Algen, zumeist Dinoflagellaten. Diese produzieren…

Bakterien, Archaeen und Viren

Faszination Forschung: Bakterien bringen das Meer zum Leuchten Eines Nachts im Januar 1995 fuhr das britische Handelsschiff Lima vor der Kuste Somalias am Horn von Afrika entlang. Da diese Gegend beruchtigt fur Piratenbanden ist, hielt die Mannschaft aufmerksam Ausschau auf das Meer und entdeckte plotzlich am Horizont ein gespenstisches weisliches Leuchten – direkt und unvermeidbar in ihrer Fahrtrichtung. War dieser seltsame Anblick ein Trick der Piraten? Nur 15 min. nach der Entdeckung des Leuchtens war die Lima umgeben von leuchtendem Wasser, soweit das Auge der Crew reichte. Im Logbuch des Schiffes war festgehalten: „Es schien, als fahre das Schiff uber eine Schneefeld oder gleite uber e…

Die Evolution und Vielfalt der Pilze

Faszination Forschung: Die zufallige Entdeckung der Antibiotika Alexander Fleming war im Jahr 1928 bereits ein bekannter Wissenschaftler, aber in seinem Labor herrschte haufig ein groses Durcheinander. In jenem Jahr erforschte er die Eigenschaften von Bakterien der Gattung Staphylococcus, Erreger der gefahrlichen Staphylokokkeninfektionen. Im August begab er sich mit seiner Familie auf eine langere Reise. Bei seiner Ruckkehr im September stellte er fest, dass einige seiner Petrischalen mit Staphylokokken von einem Pilz infiziert waren, der zahlreiche Bakterien abgetotet hatte. Viele Wissenschaftler hatten den Verlust bedauert, die Petrischalen weggeworfen und neue Bakterienkulturen angesetz…

Evolution of tissue-specific keratins as deduced from novel cDNA sequences of the lungfish Protopterus aethiopicus.

Lungfishes are possibly the closest extant relatives of the land vertebrates (tetrapods). We report here the cDNA and predicted amino acid sequences of 13 different keratins (ten type I and three type II) of the lungfish Protopterus aethiopicus. These keratins include the orthologs of human K8 and K18. The lungfish keratins were also identified in tissue extracts using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, keratin blot binding assays and immunoblotting. The identified keratin spots were analyzed by peptide mass fingerprinting which assigned seven sequences (inclusively Protopterus K8 and K18) to their respective protein spot. The peptide mass fingerprints also revealed the fac…

Electron microscopy of a double helical tubular filament in keyhole limpet (Megathura crenulata) hemolymph.

A approximately 25 nm hollow double helical filament has been detected ultrastructurally in the cell-free supernatant from hemolymph of the keyhole limpet Megathura crenulata (Gastropoda: Prosobranchia: Fissurellidae). Subsequently, much higher concentrations of this material were found in the cell pellet from hemolymph. Both negative staining and thin sectioning have been performed in an attempt to obtain a preliminary structural characterization of this new filament. It is proposed that the filaments are released or secreted from blood hemocytes in response to bleeding, but it has not been possible to define absolutely an intracellular organelle containing this material. It is shown that …

Subunit sequences of the 4 x 6-mer hemocyanin from the golden orb-web spider, Nephila inaurata. Intramolecular evolution of the chelicerate hemocyanin subunits

The transport of oxygen in the hemolymph of many arthropod and mollusc species is mediated by large copper-proteins that are referred to as hemocyanins. Arthropod hemocyanins are composed of hexamers and oligomers of hexamers. Arachnid hemocyanins usually form 4 x 6-mers consisting of seven distinct subunit types (termed a-g), although in some spider taxa deviations from this standard scheme have been observed. Applying immunological and electrophoretic methods, six distinct hemocyanin subunits were identified in the red-legged golden orb-web spider Nephila inaurata madagascariensis (Araneae: Tetragnathidae). The complete cDNA sequences of six subunits were obtained that corresponded to a-,…

The diversity and evolution of chelicerate hemocyanins

Abstract Background Oxygen transport in the hemolymph of many arthropod species is facilitated by large copper-proteins referred to as hemocyanins. Arthropod hemocyanins are hexamers or oligomers of hexamers, which are characterized by a high O2 transport capacity and a high cooperativity, thereby enhancing O2 supply. Hemocyanin subunit sequences had been available from horseshoe crabs (Xiphosura) and various spiders (Araneae), but not from any other chelicerate taxon. To trace the evolution of hemocyanins and the emergence of the large hemocyanin oligomers, hemocyanin cDNA sequences were obtained from representatives of selected chelicerate classes. Results Hemocyanin subunits from a sea s…

3-D reconstruction of hemocyanins and other invertebrate hemolymph proteins by cryo-TEM: an overview.

Zellen: die kleinsten Einheiten des Lebens

Faszination Forschung: Naturlicher Sonnenschutz Sonnenlicht spielt fur das Leben eine zentrale Rolle, denn es liefert die Energie, die von den Pflanzen im Zuge der Photosynthese in chemische Energie umgewandelt wird. Die in unserer Nahrung in Form von chemischen Bindungen gespeicherte Energie stammt letztlich von der Sonne. Doch das Sonnenlicht hat auch weniger positive, wenn nicht gar verheerende Nebenwirkungen: Ein gewisser Anteil der elektromagnetischen Strahlung, das energiereiche ultraviolette (UV-)Licht, schadigt das genetische Material in den Zellen, die DNA. Auch ohne genaue Kenntnisse dieser Prozesse achten wir meist darauf, uns keiner ubermasigen Dosis Sonnenlicht auszusetzen, ent…

Recombinant expression of gastropod (Biomphalaria glabrata) haemoglobin

Genmutationen und molekulare Medizin

Faszination Forschung: Der Angelina-Jolie-Effekt Die Schauspielerin Angelina Jolie erstaunte viele Menschen mit der Bekanntgabe, dass sie sich das Drusengewebe beider Bruste hat entfernen lassen, nachdem sie erfahren hatte, dass sie eine Mutation im „Brustkrebsgen“ tragt. Angelina Jolie war durchaus mit Recht besorgt, denn selbst ohne einen genetischen Test deutete ihre Familiengeschichte darauf hin, dass sie unter einem hohen Krebsrisiko stand. Ihre Mutter hatte Brustkrebs gehabt und war im Alter von 56 Jahren gestorben. Auch ihre Tante war an Brustkrebs gestorben, ihre Grosmutter an Eierstockkrebs. Angelina Jolie erfuhr, dass eine Mutation im BRCA1-Gen fur eine vererbbare Form von Eiersto…

Allosterism of Nautilus pompilius hemocyanin as deduced from 8 Å cryo-EM structures obtained under oxy and deoxy conditions

Hemocyanins are the blue copper-containing respiratory proteins of many molluscs. Nautilus pompilius hemocyanin (NpH) is a cylindrical decamer composed of ten copies of a 350 kDa polypeptide subunit, in turn consisting of seven O2-binding functional units (FUs, termed NpH-a to NpH-g). Ten copies of the subunit segment NpH-a to NpH-f form the cylinder wall (ca. 35 nm in diameter), whereas the ten copies of NpH-g build the internal collar. Recently we published a 9A cryo-EM structure and molecular model of NpH that solved the principal architecture of this protein [1]. Hemocyanins are highly allosteric, and the cooperativity of oxygen binding should be transferred between functional units by …

Verhalten von Tieren

Faszination Forschung: Ein angeborenes Lernverhalten In jedem Fruhjahr kann man die herrlichen Gesange der Vogel horen. Weshalb singen Vogel? Singvogelmannchen lassen ihre artspezifischen Gesange erklingen, weil sie mit anderen Mannchen um ein Revier konkurrieren, und sie singen auch, um Partnerinnen anzulocken. Viele Weibchen singen zwar nicht, aber sie erkennen die Gesange ihrer eigenen Art. Die Mannchen der meisten Arten, wie der Dachsammer (Zonotrichia leucophrys), mussen ihre Gesange erlernen. Was sie lernen konnen, wird von ihren Genen beeinflusst, und wann sie lernen konnen, hangt von ihrer Physiologie ab. Ein mannliches Junges im Nest hort seinen Vater und andere Dachsammern singen.…

Topology of the 10 subunits within the decamer of KLH, the hemocyanin of the marine gastropod Megathura crenulata.

Immunoelectron microscopy has been performed using negatively stained immune complexes of keyhole limpet hemocyanin isoform 1 (KLH1) decamers and a functional unit-specific monoclonal antibody anti-KLH1-c1. The antibody links hemocyanin molecules at both the collar and the collarless edge of the decamer, indicating a peripheral localization of functional units c. In isoform 2 (KLH2) the positions of functional units c have been identified with the peanut agglutinin (PNA), which has previously been shown to exclusively bind to KLH2-c. Ferritin linked to PNA was used to visualize labeled molecules electron microscopically. The pattern of labeling also indicates a peripheral localization of th…

Die Entstehung der Tiere und die Evolution ihrer Körperbaupläne

Faszination Forschung: Die Entdeckung eines mysteriosen Tieres in einem Aquarium Im Jahr 1883 machte der Zoologe Franz Schulze in seinem Labor in Graz, Osterreich, eine bemerkenswerte Entdeckung: An den Scheiben seines Meerwasseraquariums krochen plotzlich abgeflachte, transparente Organismen. Offenbar waren diese nur millimetergrosen Lebewesen zufallig zusammen mit den Schwammen, an denen Schulze primar interessiert war, in sein Aquarium gelangt, und es handelte sich wohl um Tiere. Sie sahen jedoch vollig anders aus als jegliche zuvor beschriebenen Tiere – vor allem, weil sie wahrend der Fortbewegung standig ihre Gestalt anderten. Wie eine nahere Untersuchung dieser neuartigen Organismen e…

Fortpflanzung bei Blütenpflanzen

Faszination Forschung: Welche Signale losen das Bluhen aus? Die rot-grunen Straucher, die im ganzen Suden von Kalifornien wuchsen und aus denen Mexikaner einen roten Farbstoff gewannen, ubten auf den Milchbauer Albert Ecke eine grose Faszination aus. Dieser Strauch mit dem wissenschaftlichen Namen Euphorbia pulcherrima erhielt seinen Trivialnamen Poinsettie nach jenem Mann, der ihn erstmals in die Vereinigten Staaten brachte: Joel Roberts Poinsett, erster US-Botschafter in Mexiko. Anfang des 20. Jahrhunderts begann Ecke, die Pflanzen auf seiner Farm in Hollywood zu verkaufen. Bevor sich ein kommerzieller Erfolg einstellen konnte, mussten jedoch erst zwei Hindernisse uberwunden werden.

Quaternary structure of the European spiny lobster (Palinurus elephas) 1x6-mer hemocyanin from cryoEM and amino acid sequence data.

Abstract Arthropod hemocyanins are large respiratory proteins that are composed of up to 48 subunits (8×6-mer) in the 75 kDa range. A 3D reconstruction of the 1×6-mer hemocyanin from the European spiny lobster Palinurus elephas has been performed from 9970 single particles using cryoelectron microscopy. An 8 A resolution of the hemocyanin 3D reconstruction has been obtained from about 600 final class averages. Visualisation of structural elements such as α-helices has been achieved. An amino acid sequence alignment shows the high sequence identity (>80%) of the hemocyanin subunits from the European spiny lobster P. elephas and the American spiny lobster Panulirus interruptus . Comparison of…

Das Nervensystem von Säugern: Struktur und höhere Funktionen

Faszination Forschung: Fahren Sie Taxi, das trainiert Ihr Gehirn Gehen Sie doch einmal auf einen Kartendienst im Internet und vergleichen Sie London mit New York City, wobei Sie denselben Masstab wahlen. In welcher Stadt ist es wohl einfacher, als Taxifahrer zu arbeiten? Eleanor Maguire war von den navigatorischen Fahigkeiten der Londoner Taxifahrer so beeindruckt, dass sie sich entschloss zu uberprufen, ob deren Gehirne irgendwelche besonderen Merkmale aufweisen. Mit einem computergestutzten, bildgebenden Verfahren, der Magnetresonanztomographie, untersuchten Maguire und ihre Kollegen die Gehirne von Taxifahrern mit unterschiedlich langer Berufserfahrung und verglichen sie sowohl untereina…

Samenlose Pflanzen: Übergang vom Wasser ans Land

Faszination Forschung: Giftverschmutzung durch fossile Algen aus der Urzeit Es geschah am 20. April 2010: Wahrend einer Erkundungsbohrung der Olplattform Deepwater Horizon im Golf von Mexiko, etwa 60 km sudlich der Kuste der USA, kam es in 1500 m Tiefe zu einem explosionsartigen Blowout, der nicht unter Kontrolle gebracht werden konnte. Im Laufe der nachsten drei Monate traten aus der Bohrung fast 5 Mio. Barrel Erdol in den Golf von Mexiko aus und machten dieses Ereignis zur schlimmsten marinen Olkatastrophe der Geschichte. Dieser Olpest fielen unzahlige Meereslebewesen zum Opfer, und auch an der Kuste verursachte sie erhebliche Schaden, weil das an der Oberflache treibende Ol an die Strand…

The refined structure of functional unit h of keyhole limpet hemocyanin (KLH1-h) reveals disulfide bridges

Hemocyanins are multimeric oxygen-transport proteins in the hemolymph of many arthropods and mollusks. The overall molecular architecture of arthropod and molluscan hemocyanin is very different, although they possess a similar binuclear type 3 copper center to bind oxygen in a side-on conformation. Gastropod hemocyanin is a 35 nm cylindrical didecamer (2 × 10-mer) based on a 400 kDa subunit. The latter is subdivided into eight paralogous “functional units” (FU-a to FU-h), each with an active site. FU-a to FU-f contribute to the cylinder wall, whereas FU-g and FU-h form the internal collar complex. Atomic structures of FU-e and FU-g, and a 9 A cryoEM structure of the 8 MDa didecamer are avai…

Zebrafish vimentin: molecular characterization, assembly properties and developmental expression

To provide a basis for the investigation of the intermediate filament (IF) protein vimentin in one of the most promising experimental vertebrate systems, the zebrafish (Danio rerio), we have isolated a cDNA clone of high sequence identity to and with the characteristic features of human vimentin. Using this clone we produced recombinant zebrafish vimentin and studied its assembly behaviour. Unlike other vimentins, zebrafish vimentin formed unusually thick filaments when assembled at temperatures below 21 degrees C. At 37 degrees C few filaments were observed, which often also terminated in aggregated masses, indicating that its assembly was severely disturbed at this temperature. Between 21…

Quaternary and subunit structure of Calliphora arylphorin as deduced from electron microscopy, electrophoresis, and sequence similarities with arthropod hemocyanin

Arylphorin was purified from larvae of the blowfly Calliphora vicina and studied in its oligomeric form and after dissociation at pH 9.6 into native subunits. In accordance with earlier literature, it was electrophoretically shown to be a 500 kDa hexamer (1 x 6) consisting of 78 kDa polypeptides (= subunits). Electron micrographs of negatively stained hexamers show a characteristic curvilinear, equilateral triangle of 12 nm in diameter (top view) and a rectangle measuring 10 x 12 nm (side view). Alternatively, particles in the top view orientation exhibit a roughly circular shape 12 nm in diameter. Crossed immunoelectrophoresis revealed the presence of a major subunit type; the nature of a …

Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units.

Abstract Hemocyanins are blue copper-containing respiratory proteins in the hemolymph of many arthropods and molluscs. Molluscan hemocyanins are decamers, didecamers, or multidecamers of a 340- to 400-kDa polypeptide subunit containing seven or eight globular functional units (FUs; FU-a to FU-h), each with an oxygen-binding site. The decamers are short 35-nm hollow cylinders, with their lumen narrowed by a collar complex. Our recently published 9-A cryo-electron microscopy/crystal structure hybrid model of a 3.4-MDa cephalopod hemocyanin decamer [Nautilus pompilius hemocyanin (NpH)] revealed the pathway of the seven-FU subunit (340 kDa), 15 types of inter-FU interface, and an asymmetric col…

Hemocyanin subunit organization of the gastropod Rapana thomasiana

Abstract RtH1 and RtH2, the two hemocyanin isoforms of the prosobranch gastropod Rapana thomasiana, have been purified by anion-exchange chromatography and studied by SDS–PAGE and immunoelectrophoresis. Both subunit types are built up of eight functional units (FUs). Under reducing conditions subunit RtH2 splits into two fragments, RtH2- a – f and RtH2- gh, suggesting the presence of a disulfide bridge between FU2- f and FU2- g. By proteolytic cleavage of the subunits into three-, two-, and single-FU fragments, purification of fragments by HPLC, N-terminal sequencing of the peptides, and crossed-line immunoelectrophoresis, FUs- a – h of RtH2 and FU- a, FU- d, FU- e, and FU- f of RtH1 were i…

Die Evolution der Samenpflanzen

Faszination Forschung: Von den Toten wieder zum Leben erweckt – durch Samen Die Fruchte der Judaischen Dattelpalme waren einst sehr begehrt, geschatzt wegen ihres Nahrwerts und ihrer medizinischen Eigenschaften. Im biblischen „Land, wo Milch und Honig fliesen“ bildete sie die Quelle fur den Honig. Heute ist diese uralte Dattelpalmensorte verschwunden. Oder vielleicht doch nicht? Vor etwa 2000 Jahren entwickelte sich in der Frucht einer Judaischen Dattelpalme ein Samen. Die Frucht mit diesem Samen gelangte in einen Lagerraum in der Festung Masada in Judaa. Im Jahr 73 n. Chr. suchte ein Trupp judischer Zeloten, die an einem Aufstand gegen Rom beteiligt waren, hier mit ihren Familien und ihrem…

Structure, diversity and evolution of myriapod hemocyanins

Oxygen transport in the hemolymph of many arthropods is mediated by hemocyanins, large copper-containing proteins that are well-studied in Chelicerata and Crustacea, but had long been considered unnecessary in the subphylum of Myriapoda. Only recently has it become evident that hemocyanins are present in Scutigeromorpha (Chilopoda) and Spirostreptida (Diplopoda). Here we present evidence for a more widespread occurrence of hemocyanin in the myriapods. By means of RT-PCR, western blotting and database searches, hemocyanins were identified in the symphylans Hanseniella audax and Symphylella vulgaris, the chilopod Scolopendra subspinipes dehaani and the diplopod Polydesmus angustus. No hemocya…

Mass determination, subunit organization and control of oligomerization states of keyhole limpet hemocyanin (KLH).

Analytical dark-field scanning transmission electron microscopy (STEM) of freeze-dried unstained specimens of keyhole limpet hemocyanin (KLH; from Megathura crenulata, a prosobranch gastropod) gave a molecular mass of 400 kDa for the subunit of KLH1 and of 345 kDa for the subunit of KLH2, which confirms our published values from SDS/PAGE. Within the 400-kDa KLH1 subunit we identified, by limited proteolysis, isolation of fragments and N-terminal sequencing, eight distinct 45-60 kDa functional domains (termed 1a through 1h) and determined their sequential arrangement. The KLH1 domains differ biochemically and immunologically from each other and from the previously characterized seven domains…

Physiologie, Homöostase und Temperaturregulation

Faszination Forschung: Warme setzt der korperlichen Leistungsfahigkeit Grenzen Der New-York-City-Marathon 2008 fand an einem kalten, klaren, windigen Tag im November statt. Zum dritten Mal war die Erstplatzierte in diesem Rennen uber 41 km die Weltrekordhalterin Paula Radcliffe. Auch 2004, bei den Olympischen Spielen, war Radcliffe hohe Favoritin des Frauenmarathons gewesen. Aber dieser Lauf fand an einem heisen (34 \({}^{\circ}\)C), feuchten Tag in Athen statt, und Radcliffe kollabierte 6 km vor der Ziellinie aufgrund von Hitzestress. Spitzendauerlaufer kommen in der Regel dann am besten zurecht, wenn die Umgebungstemperatur unter 10 \({}^{\circ}\)C liegt. Der Boston-Marathon 2012 fiel mit…

Evolution von Genen und Genomen

Faszination Forschung: Die Evolutionstheorie tragt zur Entwicklung besserer Grippeimpfstoffe bei Der Erste Weltkrieg endete im November 1918. Die Zahl der Todesfalle in den vier Kriegsjahren wurde jedoch schon bald ubertroffen von den Opfern einer massiven Grippeepidemie, an der weltweit uber 50 Mio. Menschen starben – und damit mehr als doppelt so viele wie in den Schlachten des Ersten Weltkriegs. Die Pandemie von 1918/1919 war insofern bemerkenswert, als die Sterberate unter jungen Erwachsenen, die einer Grippe gewohnlich mit viel geringerer Wahrscheinlichkeit zum Opfer fallen als Kinder und Greise, um das 20-Fache hoher lag als bei den vorherigen und spater folgenden Grippeepidemien. War…

Signalübertragung und Kommunikation zwischen Zellen

Faszination Forschung: Ein Signal fur die Partnerbindung Prariewuhlmause (Microtus ochrogaster) sind kleine Nagetiere, die in den gemasigten Klimazonen der Vereinigten Staaten leben, wo sie Getreidefelder untertunneln. Trifft ein mannliches Tier auf ein Weibchen, wird die Paarungsbereitschaft des Weibchens initiiert und es kommt zum Geschlechtsakt, der haufig Stunden dauert. Nach der Paarung bleiben die beiden Tiere zusammen, bauen ein Nest und sorgen gemeinsam fur den Nachwuchs. Die beiden Wuhlmause sind so eng miteinander verbunden, dass sie ab jetzt zeitlebens zusammenbleiben. Vollkommen anders verhalt sich dagegen die Rocky-Mountains-Wuhlmaus (Microtus montanus), eine eng verwandte Art,…

Keyhole Limpet Hemocyanin Type 2 (KLH2): Detection and Immunolocalization of a Labile Functional Unit h

Keyhole limpet hemocyanin (KLH) is a mixture of two hemocyanin isoforms, termed KLH1 and KLH2. Within KLH1 eight oxygen-binding functional units (FUs), 1-a to 1-h, have been identified, in contrast to KLH2, which was previously thought to be organized in seven FUs (2-a to 2-g). By limited proteolysis of KLH2 subunits, isolation of the polypeptide fragments, and N-terminal sequencing, we have now identified an eighth FU of type h, with a molecular mass of 43 kDa. This is unusually small for a FU h from a gastropodan hemocyanin. It is also shown that KLH2 didecamers can be split into a stable and homogeneous population of decamers by dialysis against 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, in the absence of …

Tracing keratin evolution: catalog, expression patterns and primary structure of shark (Scyliorhinus stellaris) keratins.

We have studied individual keratins of an elasmobranch, the shark Scyliorhinus stellaris (the lesser-spotted dogfish). From various shark tissues, notably skin and stomach, cytoskeletal proteins were isolated and then separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Using complementary keratin blot-binding assays and immunoblotting, among these proteins we identified a variety of type I and type II keratins. According to their tissue-specific expression, we distinguished Is and IIs keratins from IE and IIE keratins ("S" and "E" from "simple epithelial" and "epidermal", respectively). Guinea pig antibodies which in immunoblots specifically labeled the entire range of identifi…

Die Rekonstruktion der Phylogenie und ihre Anwendungen

Faszination Forschung: Verbesserung eines genetischen Werkzeugs mittels der Phylogenie Das grun fluoreszierende Protein (GFP) wurde im Jahr 1962 entdeckt. Damals gelang es einem japanischen Forscherteam unter der Leitung von Osamu Shimomura, dieses Protein aus den Geweben der biolumineszenten Qualle Aequorea victoria zu isolieren. Das Erstaunliche war, dass dieses Protein, anders als zum Beispiel beim Leuchtsystem der Gluhwurmchen, ohne jeden Cofaktor leuchtete. Rund 30 Jahre nach der Entdeckung von GFP hatte Martin Chalfie die Idee (und die entsprechenden Techniken zur Verfugung), das Gen fur GFP mit anderen proteincodierenden Genen zu verknupfen und damit die Expression bestimmter interes…

Gene, Entwicklung und Evolution

Faszination Forschung: Stammzelltherapie Ruby war in die Jahre gekommen und wie viele in ihrem Alter litt sie unter einer Huftgelenksarthrose. Eine Arthrose ist eine degenerative Gelenkerkrankung, die durch eine Veranderung und den Abbau der schutzenden Knorpelschicht auf der Knochenoberflache im Bereich der Gelenke hervorgerufen wird, welche Entzundungsprozesse auslost und Schmerzen verursachen. So konnten dann auch die Menschen, die sich um Ruby kummerten, die Knochen in ihren Huftgelenken mahlen horen, wenn sie versuchte sich fortzubewegen. Der Arzt empfahl eine Huftoperation, bei der ein kunstliches Huftgelenk eingesetzt werden sollte, doch Karen und Dave hatten fur ihren geliebten Coll…

Organization into Higher Ordered Ring Structures Counteracts Membrane Binding of IM30, a Protein Associated with Inner Membranes in Chloroplasts and Cyanobacteria.

The IM30 (inner membrane-associated protein of 30 kDa), also known as the Vipp1 (vesicle-inducing protein in plastids 1), has a crucial role in thylakoid membrane biogenesis and maintenance. Recent results suggest that the protein binds peripherally to membranes containing negatively charged lipids. However, although IM30 monomers interact and assemble into large oligomeric ring complexes with different numbers of monomers, it is still an open question whether ring formation is crucial for membrane interaction. Here we show that binding of IM30 rings to negatively charged phosphatidylglycerol membrane surfaces results in a higher ordered membrane state, both in the head group and in the inn…

Stoffwechselwege zur Gewinnung chemischer Energie

Faszination Forschung: Ein gewichtiges Problem In Deutschland sind, wie aktuelle Erhebungen belegen, 7 % der Kinder und 24 % der Erwachsenen als fettleibig (adipos) einzustufen. Die Zahlen sind so alarmierend, dass Mediziner mittlerweile von einer Adipositasepidemie sprechen. Und auch Erkrankungen, die mit Adipositas (Fettleibigkeit) assoziiert sind, darunter Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs, haben in den vergangenen Jahren dramatisch zugenommen und Gesundheitsbehorden wie Mediziner auf den Plan gerufen. Obwohl ernahrungswissenschaftliche Untersuchungen zeigen, dass nicht alle Menschen auf alle Lebensmittel gleich reagieren, lasst sich fur die meisten Betroffenen doch eine al…

10-A cryoEM structure and molecular model of the Myriapod (Scutigera) 6x6mer hemocyanin:understanding a giant oxygen transport protein

Oxygen transport in Myriapoda is maintained by a unique 6x6mer hemocyanin, that is, 36 subunits arranged as six hexamers (1x6mers). In the sluggish diplopod Spirostreptus, the 1x6mers seem to operate as almost or fully independent allosteric units (h approximately 1.3; P(50) approximately 5 torr), whereas in the swift centipede Scutigera, they intensively cooperate allosterically (h approximately 10; P(50) approximately 50 torr). Here, we show the chemomechanical basis of this differential behavior as deduced from hybrid 6x6mer structures, obtained by single-particle cryo-electron microscopy of the Scutigera 6x6mer (10.0 A resolution according to the 0.5 criterion) and docking of homology-m…

Abiotische Umwelt und Biogeographie der Organismen

Faszination Forschung: Das groste Experiment der Welt Auf der Erde leben sehr viele verschiedene Arten, und fast taglich werden neue Spezies entdeckt – das ist den meisten Menschen bewusst. Weniger bekannt ist jedoch, dass ungefahr die Halfte aller bekannten Arten der Erde in einer einzigen Region vorkommt: in den tropischen Regenwaldern des Amazonasbeckens. Die statistischen Daten sind uberwaltigend: In Amazonien wachsen rund 390 Mrd. Baume aus 16.000 Arten, hier leben 20 % aller Vogelarten der Erde, und auf die Hange und Taler ergiest sich ein Funftel der gesamten globalen Niederschlage. Das macht das Amazonasbecken zum weltweit mit Abstand grosten Wassereinzugsgebiet: Tausende Nebenfluss…

Die Biosphäre im Wandel

Faszination Forschung: Besiegelt ein todlicher Pilz das Schicksal der Frosche? Sicher sind Sie schon einmal an einem Teich oder Tumpel auf einen Frosch gestosen. Auf Amphibien zu treffen, ist eigentlich nichts Ausergewohnliches. Seit Ende der 1980er-Jahre verzeichnen Okologen allerdings weltweit einen drastischen Ruckgang der Amphibienarten; bei ihnen ist dieser Ruckgang viel ausgepragter als bei anderen taxonomischen Gruppen, und in manchen Regionen macht er sich besonders stark bemerkbar. Seit 1980 sind 33 Amphibienarten ganz ausgestorben, weitere 115 Spezies gelten als unauffindbar (sie wurden seitdem nicht mehr beobachtet) und 848 Arten sind vom Aussterben bedroht. Einer Studie der Welt…

Transport in Pflanzen

Faszination Forschung: Durstiger Reis Pflanzen benotigen reichlich Wasser zum Wachsen. Beim Anbau von Kulturpflanzen wird mehr Wasser verbraucht als bei allen anderen menschlichen Aktivitaten zusammengenommen. Besonders problematisch ist es, in von Durren bedrohten Regionen den Wasserbedarf zu decken. Daher ist es unabdingbar, den Wasserhaushalt der Pflanzen zu verstehen, damit Pflanzen ausgelesen und gezuchtet werden konnen, die Wasser auf effizientere Weise nutzen. Ein groser Teil der beim Wachstum hinzugewonnenen Pflanzenmasse geht auf die Nettofixierung von \(\mathrm{CO_{2}}\) aus der Luft zuruck, das durch die Photosynthese in Form von Kohlenhydraten gebunden wird. Das Verhaltnis der N…

Keyhole limpet hemocyanin (KLH): a biomedical review

In this review we present a broad survey of fundamental scientific and medically applied studies on keyhole limpet hemocyanin (KLH). Commencing with the biochemistry of KLH, information on the biosynthesis and biological role of this copper-containing respiratory protein in the marine gastropod Megathura crenulata is provided. The established methods for the purification of the two isoforms of KLH (KLH1 and KLH2) are then covered, followed by detailed accounts of the molecular mass determination, functional unit (FU) structure, carbohydrate content, immunological analysis and recent aspects of the molecular genetics of KLH. The transmission electron microscope (TEM) has contributed signific…

Von der DNA zum Protein: die Genexpression

Faszination Forschung: Bekampfung von Superkeimen mithilfe des genetischen Codes Staphylococcus aureus gehort zu den Milliarden von Bakterien, die beim Menschen die Haut und die Nase besiedeln, aber grostenteils keine Krankheiten verursachen. Manchmal kann S. aureus jedoch schwere Infektionen der Haut hervorrufen, besonders wenn das Immunsystem durch Alter oder Krankheit geschwacht ist. Das Bakterium kann dann uber die Nase oder eine Hautverletzung in den Korper eindringen und dort schwere und gelegentlich auch lebensbedrohliche Infektionen in Organen hervorrufen, beispielsweise im Herz oder in der Lunge. Bis vor Kurzem wurden Infektionen mit S. aureus erfolgreich mit Penicillin und verwand…

Immunologie: Abwehrsysteme der Tiere

Faszination Forschung: Impfstoffe und Immunitat Funf kleine Ampullen in Gefrierschranken, drei in Bethesda, Maryland, eine in Atlanta, Georgia, und eine in Sibirien: Das ist alles, was heute vom Pockenvirus ubriggeblieben ist. Die Pocken toteten im 20. Jahrhundert mehr als 300 Mio. Menschen, aber dank der Pockenimpfung trat die Krankheit 1978 zum letzten Mal auf. Ein Impfstoff ist meistens eine inaktive Form oder ein Fragment eines Krankheitserregers (Pathogens) oder Toxins. Er regt das Immunsystem dazu an, Antikorper – spezifische Proteine, die gegen den Erreger gerichtet sind – zu bilden. Das Immunsystem zerstort alles, an das die Antikorper binden. Die Ausrottung des Pockenvirus war ein …

Rhogocytes (pore cells) as the site of hemocyanin biosynthesis in the marine gastropod Haliotis tuberculata.

Rhogocytes (pore cells) are specific molluscan cell types that are scattered throughout the connective tissues of diverse body parts. We have identified rhogocytes in large numbers in tissue taken from mantle, foot and midgut gland of the abalone Haliotis tuberculata (Vetigastropoda). Within cisternae of the endoplasmic reticulum, particles are visible that resemble, in shape and size, hemocyanin molecules, the respiratory protein of many molluscs. Immunohistochemical experiments using hemocyanin-specific antibodies demonstrated that these cells contain hemocyanin. In situ hybridization with a cDNA probe specific for Haliotis hemocyanin showed that hemocyanin-specific mRNA is present in rho…

Cupredoxin-like domains in haemocyanins

Haemocyanins are multimeric oxygen transport proteins, which bind oxygen to type 3 copper sites. Arthropod haemocyanins contain 75-kDa subunits, whereas molluscan haemocyanins contain 350–400-kDa subunits comprising seven or eight different 50 kDa FUs (functional units) designated FU-a to FU-h, each with an active site. FU-h possesses a tail of 100 amino acids not present in the other FUs. In the present study we show by X-ray crystallography that in FU-h of KLH1 (keyhole-limpet-haemocyanin isoform 1) the structure of the tail domain is cupredoxin-like but contains no copper. The copper-free domain 3 in arthropod haemocyanin subunits has also recently been reinterpreted as being cupredoxin-…

Proteine, Kohlenhydrate und Lipide

Faszination Forschung: Ein Netz weben Ein Spinnennetz ist ein faszinierendes Gebilde. Es ist nicht nur wunderschon anzusehen, es ist auch ein architektonisches Wunderwerk, das die Spinne als Wohnraum nutzt, das ihrer Fortpflanzung dient und mit dem sie Beutetiere fangt. Beobachten Sie eine Fliege, die zu ihrem Ungluck mit einem Spinnennetz Bekanntschaft macht. Die Faden des Netzes mussen die Fliege aus vollem Flug abfangen. Die Faden reisen aber nicht, sondern sind elastisch und nehmen die kinetische Energie des fliegenden Insekts auf. Gleichzeitig durfen die Fasern nicht zu sehr nachgeben, sondern mussen fest genug sein, um die Form des Netzes zu bewahren und es an Ort und Stelle zu halten…

Zellzyklus und Zellteilung

Faszination Forschung: Unsterbliche Zellen Am 29. Januar 1951 suchte die 30-jahrige Henrietta Lacks eine Klinik in Baltimore (USA) auf, da sie nach der Geburt ihres jungsten Kindes an anormalen Blutungen litt. Der Arzt entdeckte die Ursache fur diese Blutungen, einen Tumor, der bereits ein Viertel ihres Gebarmutterhalses umfasste. Die Untersuchung eines Tumorstucks durch einen Pathologen ergab, dass der Tumor bosartig war. Eine Woche spater kehrte Frau Lacks in die Klinik zuruck, wo die Mediziner den Tumor bestrahlten, um ihn abzutoten. Bevor sie mit der Behandlung begannen, entnahmen sie eine geringe Menge von Zellen und schickten diese ohne Zustimmung der Patientin – was damals zwar so ub…

8 Å cryo-TEM and single particle analysis of Nautilus pompilius hemocyanin under two states of oxygenation

Extended abstract of a paper presented at MC 2007, 33rd DGE Conference in Saarbrücken, Germany, September 2 – September 7, 2007

A Janus-Faced IM30 Ring Involved in Thylakoid Membrane Fusion Is Assembled from IM30 Tetramers.

Summary Biogenesis and dynamics of thylakoid membranes likely involves membrane fusion events. Membrane attachment of the inner membrane-associated protein of 30 kDa (IM30) affects the structure of the lipid bilayer, finally resulting in membrane fusion. Yet, how IM30 triggers membrane fusion is largely unclear. IM30 monomers pre-assemble into stable tetrameric building blocks, which further align to form oligomeric ring structures, and differently sized IM30 rings bind to membranes. Based on a 3D reconstruction of IM30 rings, we locate the IM30 loop 2 region at the bottom of the ring and show intact membrane binding but missing fusogenic activity of loop 2 mutants. However, helix 7, which …

Hemocyanin from the keyhole limpetMegathura crenulata(KLH) carries a novel type of N-glycans with Gal(β1-6)Man-motifs

Keyhole limpet (Megathura crenulata) hemocyanin (KLH), an extracellular respiratory protein, is widely used as hapten carrier and immune stimulant. Although it is generally accepted that the sugar constituents of this glycoprotein are likely to be implicated in the antigenicity and biomedical properties of KLH, knowledge of its carbohydrate structure is still limited. Therefore, we have investigated the N-linked oligosaccharides of KLH. Glycan chains were enzymatically liberated from tryptic glycopeptides, pyridylaminated and separated by two-dimensional HPLC. Only neutral oligosaccharides were obtained and characterized by carbohydrate constituent and methylation analyses, MALDI-TOF-MS, ES…

Entwicklung der Tiere

Faszination Forschung: Mit dem Strom schwimmen Legen Sie mal Ihre Hand auf Ihr Herz. Nun legen Sie sie auf Ihren Blinddarm. Als Nachstes auf Ihr Pankreas (Bauchspeicheldruse). Sicherlich haben Sie Ihre Hand zuerst auf die linke Seite Ihrer Brust gelegt, dann auf die rechte Seite Ihres Unterbauchs und schlieslich auf die linke Seite Ihres Oberbauchs. Wirbeltiere (einschlieslich des Menschen) sind zwar bilateralsymmetrisch gebaut, aber unsere Bilateralsymmetrie ist offensichtlich nicht durchgehend. Einige unserer inneren Organe sind zur linken Seite hin orientiert, andere zur rechten. Bei rund einem von 7000 Menschen sind die inneren Organe spiegelbildlich angeordnet, ein harmloser Zustand, d…

Complete Hemocyanin Subunit Sequences of the Hunting SpiderCupiennius salei

Hemocyanins are large copper-containing respiratory proteins found in many arthropod species. Scorpions and orthognath spiders possess a highly conserved 4 x 6-mer hemocyanin that consists of at least seven distinct subunit types (termed a to g). However, many "modern" entelegyne spiders such as Cupiennius salei differ from the standard arachnid scheme and have 2 x 6-mer hemocyanins. Here we report the complete primary structure of the 2 x 6-mer hemocyanin of C. salei as deduced from cDNA sequencing, gel electrophoresis, and matrix-assisted laser desorption spectroscopy. Six distinct subunit types (1 through 6) and three additional allelic sequences were identified. Each 1 x 6-mer half-mole…

Muskeln und Skelette

Faszination Forschung: Meister im Springen Der Weltrekord im Dreisprung der Manner liegt bei 18,26 m und wurde 1995 von Jonathan Edwards aufgestellt, durchschnittlich also uber 6 m pro Sprung (wobei diese beim Dreisprung sehr ungleich lang sind). Ein anderer Dreisprungrekord, der noch immer Bestand hat, wurde zwei Jahre fruher von Rosie the Ribeter aufgestellt, die 6,55 m weit sprang, pro Sprung im Durchschnitt also uber 2 m. Rosie war ein Ochsenfrosch (Rana catesbeiana), der 1986 in Kalifornien einen Dreisprungwettkampf fur Frosche gewann. In gewisser Hinsicht ist Rosies Rekord der eindrucksvollere, denn wahrend Jonathans Dreisprung etwa dem Zehnfachen seiner Korpergrose von 1,80 m entspra…

Keyhole limpet hemocyanin (KLH), II: Characteristic reassociation properties of purified KLH1 and KLH2.

Subunits of the two types of keyhole limpet hemocyanin (KLH1 and KLH2), purified by gel filtration chromatography and preparative polyacrylamide gel electrophoresis from Immucothel, have been used for macromolecular reassociation studies. In-vitro reassociation has been achieved with a standardized system using a Tris-saline stabilizing buffer at pH 7.4 containing 100 mM calcium and magnesium chloride at 4 degrees C. The relatively slow progress of reassociation has been monitored and the varying oligomeric forms of KLH1 and KLH2 produced have been studied by transmission electron microscopy, using specimens negatively stained with 5% ammonium molybdate containing 1% trehalose. Specimens ha…

Quaternary structure and molecular model of a 4x6mer arthropod hemocyanin in oxygenated and deoxygenated states by 3D cryo-electron microscopy

Extended abstract of a paper presented at MC 2007, 33rd DGE Conference in Saarbrücken, Germany, September 2 – September 7, 2007

Small-sized granules of biphasic bone substitutes support fast implant bed vascularization

The present study investigated the influence of granule size of 2 biphasic bone substitutes (BoneCeramic® 400-700 μm and 500-1000 μm) on the induction of multinucleated giant cells (MNGCs) and implant bed vascularization in a subcutaneous implantation model in rats. Furthermore, degradation mechanisms and particle phagocytosis of both materials were examined by transmission electron microscopy (TEM). Both granule types induced tissue reactions involving primarily mononuclear cells and only small numbers of MNGCs. Higher numbers of MNGCs were detected in the group with small granules starting on day 30, while higher vascularization was observed only at day 10 in this group. TEM analysis reve…

Blaues Blut - Struktur, Funktion und Evolution der Hämocyanine

9 Å cryo-EM structure and molecular model of a gastropod hemocyanin didecamer (KLH1) reveals the architecture of the asymmetric collar

Hemocyanins are blue copper proteins that transport oxygen in the hemolymph of many arthropods and molluscs. Molluscan hemocyanins are decamers, didecamers or multidecamers of a 350–400 kDa polypeptide subunit that is subdivided into seven or eight different functional units (FUs, each with a single copper active site). The quaternary structure is a semi-hollow cylinder consisting of a wall and a collar. Recently, we published a 9 A cryo-EM structure and molecular model of a cephalopod hemocyanin decamer (NpH, from Nautilus pompilius) that answered many hitherto unsolved questions concerning the quaternary structure of molluscan hemocyanin. Notably, it revealed the twisted pathway of the 10…

Photosynthese: Energie aus dem Sonnenlicht

Faszination Forschung: Photosynthese und die globale Klimaveranderung Es war im Juli 2014, als die NASA einen Forschungssatelliten ins All schickte, um die Photosynthese auf der Erde zu messen. An Bord des Orbiting Carbon Observatory (OCO), so der Name des Satelliten, befanden sich Gerate, die nicht nur die Konzentration des Kohlenstoffdioxids (\(\mathrm{CO_{2}}\)) kartieren, sondern auch die Menge des auf der Erdoberflache vorhandenen grunen Pflanzenpigments Chlorophyll ermitteln sollten. Aber warum sollten es diese Messungen sein und warum zu diesem Zeitpunkt?

8 Å cryo-EM structure of the giant hemoglobin from the planorbid snail Biomphalaria glabrata

Until 2006, snail red hemoglobin remained a phylogenetic enigma because it occurs quite isolated in a single gastropod family, the Planorbidae, whereas all other gastropods use blue hemocyanin as a respiratory protein (for recent cryo-EM of hemocyanin, see [1,2]). Moreover, sequence data on this snail hemoglobin were completely lacking. In 2006, our group published the complete cDNA and predicted amino acid sequence of two Biomphalaria glabrata hemoglobin polypeptides, termed BgHb1 and BgHb2 [3]. (Biomphalaria is intermediate host of the human parasite Schistosoma mansoni that causes Bilharziosis.) Resembling pearl-chains, both polypeptide subunits encompass 13 different, cysteine-free glob…

Die Geschichte des Lebens auf der Erde

Faszination Forschung: Als riesige Insekten den Himmel beherrschten Die Flugelspannweite der grosten heute lebenden Libellen gleicht in etwa der Grose einer Hand. Vor 300 Mio. Jahren lebten jedoch Libellen wie Meganeuropsis permiana mit einer Flugelspannweite von uber 70 cm – das ist mehr als viele heute lebende Greifvogel aufweisen. Diese Libellen waren damals die grosten Rauber der Lufte. Heute erreicht kein einziges flugfahiges Insekt auch nur annahernd diese Grose. Doch wahrend des Karbons und des Perms, vor 350–250 Mio. Jahren, gab es in vielen Gruppen flugfahiger Insekten gigantische Arten. Meganeuropsis ernahrte sich wahrscheinlich von riesigen Eintagsfliegen und anderen grosen Flugi…

Identification, structure, and properties of hemocyanins from Diplopod myriapoda.

Hemocyanins are copper-containing, respiratory proteins that occur in the hemolymph of many arthropod species. Here we report for the first time the presence of hemocyanins in the diplopod Myriapoda, demonstrating that these proteins are more widespread among the Arthropoda than previously thought. The hemocyanin of Spirostreptus sp. (Diplopoda: Spirostreptidae) is composed of two immunologically distinct subunits in the 75-kDa range that are most likely arranged in a 36-mer (6 x 6) native molecule. It has a high oxygen affinity (P(50) = 4.7 torr) but low cooperativity (h = 1.3 +/- 0.2). Spirostreptus hemocyanin is structurally similar to the single known hemocyanin from the myriapod taxon,…

A new automated plunger for cryopreparation of proteins in defined - even oxygen free - atmospheres

We study the structure and function of hemocyanins. They are giant extracellular oxygen carriers in the hemolymph of many molluscs and arthropods. Since some of these blue, copper-containing proteins show the highest cooperativity in nature (h = 10), one of our goals is to understand the chemomechanical interaction between the different substructures during allosteric oxygen binding.

Recombinant functional multidomain hemoglobin from the gastropod Biomphalaria glabrata

The extracellular hemoglobin multimer of the planorbid snail Biomphalaria glabrata, intermediate host of the human parasite Schistosoma mansoni, is presumed to be a 1.44 MDa complex of six 240 kDa polypeptide subunits, arranged as three disulfide-bridged dimers. The complete amino acid sequence of two subunit types (BgHb1 and BgHb2), and the partial sequence of a third type (BgHb3) are known. Each subunit encompasses 13 paralogus heme domains, and N-terminally a smaller plug domain responsible for subunit dimerization. We report here the recombinant expression of different functional fragments of BgHb2 in Escherichia coli, and of the complete functional subunits BgHb1 and BgHb2 in insect ce…

Abalone (Haliotis tuberculata) hemocyanin type 1 (HtH1) . Organization of the = 400 kDa subunit, and amino acid sequence of its functional units f, g and h

We have identified two separate hemocyanin types (HtH1 and HtH2) in the European abalone Haliotis tuberculata. HtH1/HtH2 hybrid molecules were not found. By selective dissociation of HtH2 we isolated HtH1 which, as revealed by electron microscopy and SDS/PAGE, is present as didecamers of a approximately 400 kDa subunit. Immunologically, HtH1 and HtH2 correspond to keyhole limpet hemocyanin (KLH)1 and KLH2, respectively, the two well-studied hemocyanin types of the closely related marine gastropod Megathura crenulata. On the basis of limited proteolytic cleavage, two-dimensional immunoelectrophoresis, SDS/PAGE and N-terminal sequencing, we identified eight different 40-60 kDa functional unit…

Red blood with blue-blood ancestry: Intriguing structure of a snail hemoglobin

The phylogenetic enigma of snail hemoglobin, its isolated occurrence in a single gastropod family, the Planorbidae, and the lack of sequence data, stimulated the present study. We present here the complete cDNA and predicted amino acid sequence of two hemoglobin polypeptides from the planorbid Biomphalaria glabrata (intermediate host snail for the human parasite Schistosoma mansoni ). Both isoforms contain 13 different, cysteine-free globin domains, plus a small N-terminal nonglobin “plug” domain with three cysteines for subunit dimerization (total M r ≈ 238 kDa). We also identified the native hemoglobin molecule and present here a preliminary 3D reconstruction from electron microscopical …

Haliotis tuberculata hemocyanin (HtH): analysis of oligomeric stability of HtH1 and HtH2, and comparison with keyhole limpet hemocyanin KLH1 and KLH2

The multimeric/higher oligomeric states of the two isoforms of Haliotis tuberculata hemocyanin (HtH1 and HtH2) have been assessed by transmission electron microscopy (TEM) of negatively stained specimens, for comparison with previously published structural data from keyhole limpet hemocyanin (KLH1 and KLH2) [see Harris, J.R., Gebauer, W., Guderian, F.U., Markl, J., 1997a. Keyhole limpet hemocyanin (KLH), I: Reassociation from Immucothel followed by separation of KLH1 and KLH2. Micron, 28, 31-41; Harris, J.R., Gebauer, W., Söhngen, S.M., Nermut, M.V., Markl, J., 1997b. Keyhole limpet hemocyanin (KLH). II: Characteristic reassociation properties of purified KLH1 and KLH2. Micron, 28, 43-56; H…

Keyhole limpet hemocyanin (KLH), I: Reassociation from Immucothel® followed by separation of KLH1 and KLH2

Abstract Studies of keyhole limpet hemocyanin (KLH) normally require purification of functional complexes directly from living animals. An alternative procedure is described wherein a commercial preparation of KLH which is fully dissociated into its subunits (Immucothel®, biosyn Arzneimittel GmbH) is reassociated in the presence of a high concentration of calcium and magnesium. The reassociation products, when observed by electron microscopy, consist of didecamers, multidecamers and flexible tubules of varying length. The two forms of KLH described previously and designated KLH1 and KLH2, are present in the reassocated mixture as homo-oligomers/polymers and can be separated by selective dis…

On the Ultrastructure and Function of Rhogocytes from the Pond Snail Lymnaea stagnalis

Rhogocytes, also termed “pore cells”, occur as solitary or clustered cells in the connective tissue of gastropod molluscs. Rhogocytes possess an enveloping lamina of extracellular matrix and enigmatic extracellular lacunae bridged by cytoplasmic bars that form 20 nm diaphragmatic slits likely to act as a molecular sieve. Recent papers highlight the embryogenesis and ultrastructure of these cells, and their role in heavy metal detoxification. Rhogocytes are the site of hemocyanin or hemoglobin biosynthesis in gastropods. Based on electron microscopy, we recently proposed a possible pathway of hemoglobin exocytosis through the slit apparatus, and provided molecular evidence of a common phylog…

cDNA sequences of the authentic keratins 8 and 18 in zebrafish

From the zebrafish Danio rerio, we have cDNA cloned and sequenced a novel type II and a novel type I keratin, termed DreK8 and DreK18, respectively. We identified DreK8/18 as the true orthologs of the human keratin pair K8/18 as follows: (i) MALDI-MS assignment to the biochemically identified K8 and K18 candidates that are co-expressed in simple epithelia and absent in epidermal keratinocytes; (ii) multiple sequence alignments and phylogenetic tree analysis, showing that DreK8, within the phylogenetic tree of type II keratins, forms a highly bootstrap-supported branch together with K8 from goldfish and rainbow trout, whereas DreK18, within the phylogenetic tree of type I keratins, groups wi…

Mineralstoffversorgung der Pflanzen

Faszination Forschung: Eine verbesserte Mineralstoffversorgung von Pflanzen zur Ernahrung der Weltbevolkerung Nutzpflanzen wie Reis, Weizen und Mais machen mehr als die Halfte der menschlichen Ernahrung aus. Damit solche Pflanzen gut wachsen, mussen sie ausreichend mit bestimmten Mineralstoffen versorgt sein. Oft herrscht in Boden jedoch ein Mangel an diesen Mineralstoffen, das gilt insbesondere fur geeignete Stickstoffverbindungen. Beim biologischen Anbau sorgt traditionell das Ausbringen von tierischen Exkrementen (Dung) auf den Feldern fur eine Stickstoffzufuhr. Die komplexen Makromolekule im Dung werden auf naturliche Weise, das heist von Mikroorganismen, abgebaut, wobei unter anderem A…

Leben und Chemie: kleine Moleküle

Faszination Forschung: Auf den Spuren eines Dinosauriers „Man ist, was man isst – und das gilt auch fur die Zahne“ ist eine Abwandlung einer gelaufigen Redewendung zu den in unserem Korper ablaufenden chemischen Prozessen. Eines der bedeutendsten Elemente in Organismen ist Sauerstoff (O), der unter anderem ein Bestandteil des Wassermolekuls (\(\mathrm{H_{2}O}\)) ist. Sauerstoff kommt in der Natur in zwei naturlichen Varianten vor, die man als Isotope bezeichnet. Isotope besitzen zwar weitgehend dieselben chemischen Eigenschaften, sie unterscheiden sich jedoch in ihrer Masse, da ihre Atomkerne eine unterschiedliche Zahl an Neutronen enthalten. Beide Sauerstoffisotope werden Bestandteile der …

Subunit organization of the abalone Haliotis tuberculata hemocyanin type 2 (HtH2), and the cDNA sequence encoding its functional units d, e, f, g and h.

We have developed a HPLC procedure to isolate the two different hemocyanin types (HtH1 and HtH2) of the European abalone Haliotis tuberculata. On the basis of limited proteolytic cleavage, two-dimensional immunoelectrophoresis, PAGE, N-terminal protein sequencing and cDNA sequencing, we have identified eight different 40-60-kDa functional units (FUs) in HtH2, termed HtH2-a to HtH2-h, and determined their linear arrangement within the elongated 400-kDa subunit. From a Haliotis cDNA library, we have isolated and sequenced a cDNA clone which encodes the five C-terminal FUs d, e, f, g and h of HtH2. As shown by multiple sequence alignments, defg of HtH2 correspond structurally to defg from Octo…

Structure of keyhole limpet hemocyanin type 1 (KLH1) at 15 Å resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstitution † 1 †This article is dedicated to the memory of Anneke van Heel. 1Edited by M.F. Moody

Abstract A three-dimensional reconstruction of keyhole limpet hemocyanin type 1 (KLH1) has been obtained using electron cryomicroscopy at liquid helium temperatures and single particle image processing. The use of a high-contrast embedding medium, 1% (w/v) glucose and 2% (w/v) ammonium molybdate (pH 7.0), enables high-resolution electron micrographs to be recorded close to focus, i.e. with excellent transfer of high-resolution information, while maintaining enough image contrast to localise the individual macromolecules in the images. When low-pass filtered to ∼45 A resolution, the new 15 A resolution reconstruction is very similar to the earlier reconstructions of gastropodan hemocyanins o…

Acetylcholine-binding protein in the hemolymph of the planorbid snail Biomphalaria glabrata is a pentagonal dodecahedron (60 subunits).

Nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) play important neurophysiological roles and are of considerable medical relevance. They have been studied extensively, greatly facilitated by the gastropod acetylcholine-binding proteins (AChBP) which represent soluble structural and functional homologues of the ligand-binding domain of nAChR. All these proteins are ring-like pentamers. Here we report that AChBP exists in the hemolymph of the planorbid snail Biomphalaria glabrata (vector of the schistosomiasis parasite) as a regular pentagonal dodecahedron, 22 nm in diameter (12 pentamers, 60 active sites). We sequenced and recombinantly expressed two ∼25 kDa polypeptides (BgAChBP1 and BgAChBP2) wit…

Hormone der Tiere

Faszination Forschung: Das Trainingshormon Manche Menschen essen sehr kalorienreich und nehmen dennoch nicht zu. Bleiben sie nur deshalb schlank, weil ihre korperliche Bewegung uberschussige Kalorien verbraucht, die sonst als Fett gespeichert wurden? Wie Sie in Abschn. 39.5erfahren haben, gibt es zwei Typen von Fettgewebe. Weises Fettgewebe speichert Lipide, und braunes Fettgewebe metabolisiert („verstoffwechselt“) Lipide, um Warme zu erzeugen, ohne ATP zu produzieren. Braunes Fettgewebe findet man bei kalteakklimatisierten Nagern, bei Winterschlafern und bei menschlichen Neugeborenen. Lange Zeit nahm man an, dass es bei erwachsenen Menschen nicht vorkommt. Kurzlich lies sich dank computerg…

Keyhole limpet haemocyanin (KLH): Purification of intact KLH1 through selective dissociation of KLH2

Abstract Keyhole limpet haemocyanin (KLH) from almost all newly captive animals contains a mixture of KLH1 and KLH2. We show that the dissociation of KLH2 can be produced during EM specimen preparation by the negative staining-carbon film (NS-CF) procedure and in solution by ammonium molybdate-PEG solutions at slightly acidic pHs. The KLH2 multidecamers split apart in the pH range 7.5-6.5 and in the pH range 6.5-6.0 the individual decamers break open and start to dissociate. At pH 5.9 the dissociation of KLH2 yields predominantly a mixture of single subunits and what appear to be subunit dimers. Over the pH range 7.0-5.7 the KLH1 didecamer remains stable. Separation of intact KLH1, in the f…

Marine tumor vaccine carriers: structure of the molluscan hemocyanins KLH and htH.

Keyhole limpet hemocyanin (KLH) is a well-established immune stimulant and hapten carrier, and Haliotis tuberculata hemocyanin (HtH) is a related product. Biologically, KLH and HtH are blue copper proteins which serve as oxygen carriers in the blood of the keyhole limpet Megathura crenulata and the abalone H. tuberculata, respectively, two marine gastropods. Both hemocyanins occur as two distinct isoforms, termed KLH1 KLH2, HtH1, and HtH2. Each of these molecules is based on a very large polypeptide chain, the subunit (molecular mass ca 400 kDa), which is folded into a series of eight globular functional units (molecular mass ca 50 kDa each). Twenty copies of this subunit form a cylindrical…

Salzhaushalt, Wasserhaushalt und Stickstoffausscheidung

Faszination Forschung: Wie Vampirfledermause Blut als schnelle Mahlzeit verwerten Blut, Schweis und Tranen schmecken salzig, weil sie Ionenkonzentrationen ahnlich der extrazellularen Flussigkeit aufweisen, welche die Korperzellen umgibt. Die Zusammensetzung und das Volumen der extrazellularen Flussigkeit werden vom Exkretionssystem reguliert. Die Herausforderung an das Exkretionssystem hangt von der Umwelt eines Tieres und seiner Lebensweise ab. Manche Wustentiere treffen nur selten, wenn uberhaupt, auf freies Wasser. Deshalb mussen sie Wasser sparen, indem sie uberschussige Ionen und stickstoffhaltige Abfallprodukte mit so wenig Wasserverlust wie moglich ausscheiden. Im Suswasser lebende K…

Structure of Mega-Hemocyanin Reveals Protein Origami in Snails

SummaryMega-hemocyanin is a 13.5 MDa oxygen transporter found in the hemolymph of some snails. Similar to typical gastropod hemocyanins, it is composed of 400 kDa building blocks but has additional 550 kDa subunits. Together, they form a large, completely filled cylinder. The structural basis for this highly complex protein packing is not known so far. Here, we report the electron cryomicroscopy (cryo-EM) structure of mega-hemocyanin complexes from two different snail species. The structures reveal that mega-hemocyanin is composed of flexible building blocks that differ in their conformation, but not in their primary structure. Like a protein origami, these flexible blocks are optimally pac…

ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space.

Molecular machines or macromolecular complexes are supramolecular assemblies of biomolecules that ensure cellular homeostasis. Structure determination of those complexes in a purified state is often a tedious undertaking due to the compositional complexity and the related relative structural instability. To improve the stability of macromolecular complexes in vitro, we present here a generic method that optimizes the stability, homogeneity and solubility of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of their thermal unfolding behaviour in the presence of various buffers and small molecules. The method includes the automated analysis of thermal unfolding curves based on a newly deve…

Biochemical identification and tissue-specific expression patterns of keratins in the zebrafish Danio rerio

We have identified a number of type I and type II keratins in the zebrafish Danio rerio by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, complementary keratin blot-binding assay and immunoblotting. These keratins range from 56 kDa to 46 kDa in molecular mass and from pH 6.6 to pH 5.2 in isoelectric point. Type II zebrafish keratins exhibit significantly higher molecular masses (56-52 kDa) compared with the type I keratins (50-48 kDa), but the isoelectric points show no significant difference between the two keratin subclasses (type II: pH 6.0-5.5; type I: pH 6.1-5.2). According to their occurrence in various zebrafish tissues, the identified keratins can be classified into "E" (epider…

Die Entstehung und Diversifizierung der Eukaryoten

Faszination Forschung: Zuverlassige Vorhersagen toxischer roter Tiden Im Sommer 2005 legte eine verheerende rote Tide entlang der Atlantikkuste Nordamerikas die Muschelindustrie lahm. Verursacht wurde diese rote Tide durch eine Blute von Dinoflagellaten der Gattung Alexandrium. Diese Einzeller produzieren ein starkes Gift, das sich in Muscheln besonders stark anreichert, weil diese von eingestrudeltem Plankton leben. Beim Verzehr von Schalentieren, die mit diesem Gift kontaminiert sind, kann es zur paralytischen Form einer Muschelvergiftung kommen (im Englischen als paralytic shellfish poisoning, PSP, bezeichnet). Mit Paralyse ist hier die Lahmung der quergestreiften Muskulatur gemeint, ins…

Energie, Enzyme und Stoffwechsel

Faszination Forschung: Wie Aspirin wirkt Trotz seines Schuttelfrostes machte Hochwurden Edward Stone einen Spaziergang. Fiebrig, erschopft und mit Gliederschmerzen kam er zu einem Weidenbaum. Ihm war nicht bekannt, dass zahlreiche Heiler in der Vergangenheit einen Extrakt der Weidenrinde zur Fiebersenkung verwendet hatten, aber ansonsten war er mit Naturheilkunde vertraut, die zahlreiche Erkrankungen lindern oder gar heilen kann. Beim Anblick der Weidenrinde fielen ihm die bitteren, fiebersenkenden und sehr teuren Rindenextrakte einiger sudamerikanischer Baume ein. Stone riss ein paar Rindenstreifen ab, begann darauf herumzukauen und bemerkte ihren ebenfalls bitteren Geschmack; auch entging…

Highly specific auto-antibodies against claudin-18 isoform 2 induced by a chimeric HBcAg virus-like particle vaccine kill tumor cells and inhibit the growth of lung metastases.

Abstract Strategies for antibody-mediated cancer immunotherapy, such as active immunization with virus-like particle (VLP)-based vaccines, are gaining increasing attention. We developed chimeric hepatitis B virus core antigen (HBcAg)-VLPs that display a surface epitope of the highly selective tumor-associated cell lineage marker claudin-18 isoform 2 (CLDN18.2) flanked by a mobility-increasing linker. Auto-antibodies elicited by immunization with these chimeric HBcAg-VLPs in 2 relevant species (mouse and rabbit) bind with high precision to native CLDN18.2 at physiologic densities on the surface of living cells but not to the corresponding epitope of the CLDN18.1 splice variant that differs b…

Comparative 11A structure of two molluscan hemocyanins from 3D cryo-electron microscopy

Abstract Hemocyanins are giant extracellular proteins that transport oxygen in the hemolymph of many molluscs. Molluscan hemocyanins are cylindrical decamers or didecamers of a 350–400 kDa subunit that contains seven or eight different covalently linked globular functional units (FUs), arranged in a linear manner. Each FU carries a single copper active site and reversibly binds one dioxygen molecule. As a consequence, the decamer can carry up to 70 or 80 O 2 molecules. Although complete sequence information is now available from several molluscan hemocyanins, many details of the quaternary structure are still unclear, including the topology of the 10 subunits within the decamer. Here we sho…

Molecular mass of macromolecules and subunits and the quaternary structure of hemoglobin from the microcrustacean Daphnia magna

The molecular masses of macromolecules and subunits of the extracellular hemoglobin from the fresh-water crustacean Daphnia magna were determined by analytical ultracentrifugation, multiangle laser light scattering and electrospray ionization mass spectrometry. The hemoglobins from hypoxia-incubated, hemoglobin-rich and normoxia-incubated, hemoglobin-poor Daphnia magna were analyzed separately. The sedimentation coefficient of the macromolecule was 17.4 +/- 0.1 S, and its molecular mass was 583 kDa (hemoglobin-rich animals) determined by AUC and 590.4 +/- 11.1 kDa (hemoglobin-rich animals) and 597.5 +/- 49 kDa (hemoglobin-poor animals), respectively, determined by multiangle laser light sca…

3D-Ultrastructure, Functions and Stress Responses of Gastropod (Biomphalaria glabrata) Rhogocytes

Rhogocytes are pore cells scattered among the connective tissue of different body parts of gastropods and other molluscs, with great variation in their number, shape and size. They are enveloped by a lamina of extracellular matrix. Their most characteristic feature is the "slit apparatus", local invaginations of the plasma membrane bridged by cytoplasmic bars, forming slits of ca. 20 nm width. A slit diaphragm creates a molecular sieve with permeation holes of 20×20 nm. In blue-blooded gastropods, rhogocytes synthesize and secrete the respiratory protein hemocyanin, and it has been proposed-though not proven-that in the rare red-blooded snail species they might synthesize and secrete the he…

A variant of Smurf2 protects mice against colitis-associated colon cancer by inducing transforming growth factor β signaling.

Background & Aims Transforming growth factor (TGF)-β signaling, which is down-regulated by the E3 ubiquitin ligase Smad ubiquitin regulating factor 2 (Smurf2), promotes development of cancer. We identified a splice variant of Smurf2 (ΔE2Smurf2) and investigated its role in colon carcinogenesis in mice. Methods Colitis-associated colon cancer was induced in mice by administration of azoxymethane, followed by 3 cycles of oral administration of dextran sodium sulfate. Messenger RNA levels of Smurf2 in colon tumors and control tissue were measured by quantitative polymerase chain reaction; lymphocyte and cytokine levels were measured in tumor and tissue samples. Results Tumor-infiltrating CD4 +…

Blood cells and the biosynthesis of hemocyanin in Sepia embryos.

Molluscan hemocyanins: News and views

Vimentin and desmin of a cartilaginous fish, the shark Scyliorhinus stellaris: Sequence, expression patterns and in vitro assembly

In the shark Scyliorhinus stellaris we have biochemically identified and cDNA-cloned orthologs of human vimentin and desmin, SstV and SstD, as deduced from immunoblotting and sequence alignment with teleost, frog and human vimentin and desmin, respectively. This allowed us to further clarify the relationship of previously identified lower vertebrate intermediate filament proteins to mammalian vimentin and desmin. Immunofluorescence microscopy with antibodies H5 and VIM13.2 showed vimentin expression in shark eye and brain and absence in epithelia, which resembles the situation in higher vertebrates. In addition, SstV is expressed in many mesenchymal cell types which corresponds to the case …

Regulation des Pflanzenwachstums

Faszination Forschung: Nobelpreis fur einen Pflanzenzuchter Biologen sind standig auf der Suche nach Moglichkeiten, um den Landwirten bei der Nahrungsmittelproduktion fur eine wachsende Bevolkerung zu helfen; dabei wurden Getreidepflanzen entwickelt, die aufgrund ihrer physiologischen Eigenschaften mehr Korner pro Pflanze bilden (gleichbedeutend mit einer Ertragssteigerung). Der Nachteil an diesem Ansatz: Allein durch das Gewicht der Samen kann die Sprossachse umknicken. Verstarkt wird dieses Problem noch, wenn dem Boden Dunger zugefugt wird und dadurch hohere Pflanzen wachsen. Die Korner vom Boden zu ernten, ist sehr schwierig; denken Sie nur daran, wie muhselig es ware, die Korner einzeln…

Rekombinante DNA und Gentechnik

Faszination Forschung: Gentechnik und Medizin Als sich Janet ihrem Buro naherte, fuhlte sich ihre linke Gesichtshalfte taub an. Sie war verwirrt und hatte Schwierigkeiten, ihr Buro zu finden. Ein Passant betatigte den Notruf und sie wurde von einer Notfallambulanz zur nahen Klinik gefahren. Janet hatte einen Schlaganfall, konnte aber zwei Tage spater vollstandig erholt an ihren Arbeitsplatz zuruckkehren. Zu einem Schlaganfall (auch Hirnschlag genannt) kann es kommen, wenn ein groses Blutgefas, das das Gehirn mit Sauerstoff und Nahrstoffen versorgt, blockiert wird. Innerhalb weniger Minuten verringert sich die Zellatmung in der betroffenen Hirnregion, und innerhalb von Minuten bis Stunden st…

Primary structure and unusual carbohydrate moiety of functional unit 2-c of keyhole limpet hemocyanin (KLH)

Abstract The complete amino acid sequence of the Megathura crenulata hemocyanin functional unit KLH2-c was determined by direct sequencing and matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry of the protein, and of peptides obtained by cleavage with EndoLysC proteinase, chymotrypsin and cyanogen bromide. This is the first complete primary structure of a functional unit c from a gastropod hemocyanin. KLH2-c consists of 420 amino acid residues. Circular dichroism spectra indicated approx. 31% β-sheet and 29% α-helix contents. A multiple sequence alignment with other molluscan hemocyanin functional units revealed average identities between 41 and 49%, but 55% in case of Octopus he…

Evolution of molluscan hemocyanins as deduced from DNA sequencing

Sequence, evolution and tissue expression patterns of an epidermal type I keratin from the shark Scyliorhinus stellaris.

From the shark Scyliorhinus stellaris we cloned and sequenced a cDNA encoding a novel type I keratin, termed SstK10. By MALDI-MS peptide mass fingerprinting of cytoskeletal proteins separated on polyacrylamide gels, we assigned SstK10 to a 46-kDa protein which is the major epidermal type I (“IE”) keratin in this fish and is specifically expressed in stratified epithelia. In a phylogenetic tree based on type I keratin sequences and with lamprey keratins applied as outgroup, SstK10 branches off in a rather basal position. This tree strongly supports the concept that teleost keratins and tetrapod keratins resulted from two independent gene radiation processes. The only exception is human K18 b…

Reaktionen der Pflanze auf Umweltstress

Faszination Forschung: Gelingt es Wissenschaftlern, krankheitsresistenten Weizen zu zuchten? Im Jahr 1998 stellte der Pflanzengenetiker William Wagoire aus Uganda an den Stangeln der Weizenpflanzen, die er zuchtete, zu seinem grosen Erstaunen rote Pusteln fest. Der Pilz, der die Pusteln verursachte, der Getreideschwarzrost (Puccinia graminis), war 25 Jahre zuvor vermeintlich ausgerottet worden. Damals kreuzte man ein Gen aus Roggen in Weizen ein, das ihn resistent gegen diese Pilzkrankheit machte. Durch diesen bahnbrechenden Erfolg gelang es, eine Nutzpflanze, die ein Drittel der menschlichen Ernahrung liefert, vor dem Befall mit einem verheerenden Pilz zu bewahren. Auch wenn zwei Generatio…

Gene structure and hemocyanin isoform HtH2 from the mollusc Haliotis tuberculata indicate early and late intron hot spots.

Abstract We have cloned and sequenced cDNAs coding for the complete primary structure of HtH2, the second hemocyanin isoform of the marine gastropod Haliotis tuberculata. The deduced protein sequence comprises 3399 amino acids, corresponding to a molecular mass of 392 kDa. It shares only 66% of structural identity with the previously analysed first isoform HtH1, and according to a molecular clock, the two isoforms of Haliotis hemocyanin separated ca. 320 million years ago. By genomic polymerase chain reaction and 5′ race, we have also sequenced the complete gene of HtH2 (18,598 bp), except of the 5′ region in front of the secreted protein. It encompasses 15 exons and 14 introns and shows se…

Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH): Slow In Vitro Reassociation of KLH1 and KLH2 from Immucothel®

Abstract Following our in vitro reassociation of keyhole limpet hemocyanin subunits in the presence of high concentrations (100 mM each) of calcium and magnesium chloride (Harris et al., 1997a, Micron 28, 31–41; 1997b, Micron 28, 43–56), we have now extended our investigations by using a buffer system containing a lower concentration of the two divalent cations (10 mM each). Reassociation of mixed KLH subunits present in the commercially available product Immucothel® was performed using a standardized buffer solution containing 50 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 and 10 mM MgCl2 (pH 7.4) over a minimum period of one week, at 4°C. This solution was selected as being close to our KLH sta…

Type I keratin cDNAs from the rainbow trout: independent radiation of keratins in fish

Five different type I keratins from a teleost fish, the rainbow trout Oncorhynchus mykiss, have been sequenced by cDNA cloning and identified at the protein level by peptide mass mapping using MALDI-MS. This showed that the entire range of type I keratins detected biochemically in this fish has now been sequenced. Three of the keratins are expressed in the epidermis (subtype Ie), whereas the other two occur in simple epithelia and mesenchymal cells (subtype Is). Among the Is keratins is an ortholog of human K18; the second Is polypeptide is clearly distinct from K18. We raised a new monoclonal antibody (F1F2, subclass IgG1) that specifically recognizes trout Is keratins, with negative react…

Type II keratin cDNAs from the rainbow trout: implications for keratin evolution.

From a teleost fish, the rainbow trout Oncorhynchus mykiss, we have cloned and sequenced cDNAs encoding five different type II keratins. The corresponding protein spots, as separated by 2D-PAGE of trout cytoskeletal preparations, have been identified by peptide mass mapping using MALDI mass spectrometry. Three of the sequenced keratins are expressed in the epidermis (subtype IIe), and two in simple epithelia and mesenchymal cells (subtype IIs). The IIs keratins are both orthologs of human K8. This leaves unsequenced only the trace component S3 of the biochemically established trout keratin catalog. A phylogenetic tree has been constructed from a multiple alignment of the rod domains of the …